WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

При обработке культуры пероксидом водорода (в концентрации 200-300 мкМ) мы не наблюдали нарушений морфологии клеток или значительного изменения их количества. Для описания состояния клеток при окислительном стрессе мы провели окрашивание на компоненты цитоскелета, актин и тубулин, и не обнаружили значительных изменений в их структуре. Мы обнаружили, что пероксид водорода вызывает торможение клеточного цикла, так что через 24 часа после добавки H2Oзначительно возрастает количество клеток в G2/М фазе. Количество апоптотических клеток при этом было минимально. При дальнейшей инкубации с пероксидом водорода происходило частичное восстановление клеточного цикла.

Мы проанализировали гибель клеток, вызванную окислительным стрессом, методом проточной цитофлуориметрии, использовав аннексин V в качестве индикатора апоптоза и иодистый пропидий для окраски некротических клеток. При добавке 200-300 мкМ пероксида водорода через 24 часа мы наблюдали лишь незначительную (не более 25%) гибель клеток. При увеличении концентрации пероксида водорода до 600 мкМ погибало около 60% клеток. На основании полученных данных мы сделали вывод, что выбранные нами концентрации пероксида водорода (200-300 мкМ) вызывают мягкий, нетоксический стресс в культуре клеток HeLa.

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ФРАГМЕНТАЦИИ МИТОХОНДРИЙ Окислительный стресс, вызванный пероксидом водорода, приводил к фрагментации митохондриального ретикулума (рис. 3). Изменения морфологии митохондрий проявлялись через 8-12 часов после добавки пероксида водорода.

Через 20-24 часа количество клеток с полностью фрагментированным митохондриальным ретикулумом варьировало от эксперимента к эксперименту, и составляло 35-65 %. В индивидуальных клетках культуры фрагментация начиналась после лаг-фазы различной длительности и затем очень быстро завершалась. В ответ на добавку миксотиазола к H2O2 фрагментация Рисунок 3. Динамика митохондриального митохондрий происходила значительно ретикулума при окислительном стрессе Клетки линии HeLa инкубировали с пероксидом водорода 250 мкМ и/или миксотиазолом 2 мкМ в быстрее (рис. 3), что коррелировало с течение указанного времени. Митохондрии выявляли MitoTracker Green по стандартной методике. Бар – 10 мкМ.

ускорением продукции АФК. Сам миксотиазол также вызывал фрагментацию митохондриального ретикулума, но значительно позже, через 36-48 часов после добавки, что также соответствовало медленному накоплению АФК.

Для изучения роли митохондриальных АФК в фрагментации митохондрий мы использовали митохондриально-направленные антиоксиданты. Мы показали, что SkQ1, SkQR1 или MitoQ вызывают эффективную защиту митохондрий от фрагментации под действием пероксида водорода (рис. 4). Защитный эффект митохондриально-направленные антиоксиданты проявляли в чрезвычайно низких концентрациях – 2-20 нМ. Использованные нами антиоксиданты общего действия Trolox и N-ацетилцистеин также предотвращали фрагментацию митохондрий, вызванную пероксидом водорода, однако, в значительно больших концентрациях – 100 мкМ и 10 мМ соответственно.

А B Рисунок 4. Митохондриально-направленные антиоксиданты предотвращают фрагментацию митохондриального ретикулума при окислительном стрессе.

Клетки HeLa предынкубировали с антиоксидантами (2 нМ) в течение 2 часов, затем добавляли пероксид водорода (250 мкМ). Через 18 часов проводили окрашивание MitoTracker Green по стандартной методике. А: Бар – 10 мкМ. В: Представлены данные трех независимых экспериментов.

Из рис. 4 видно, что митохондриально-направленные антиоксиданты различались по своей эффективности: SkQ1 и SkQR1 практически полностью подавляли фрагментацию митохондрий, в то время как MitoQ был не столь эффективен. SkQпредотвращал фрагментацию, вызванную ингибиторами дыхательной цепи митохондрий, миксотиазолом, антимицином А и пиерицидином, и не влиял на фрагментацию, вызванную ингибитором протеинкиназ клетки ставроспорином.

Последнее позволяет утверждать, что SkQ1 не нарушает механизм фрагментации митохондрий. Во всех экспериментах C12TPP (аналог SkQ1, способный накапливаться в митохондриях, но не обладающий антиоксидантным действием) не оказывал никакого эффекта. При повышении концентрации митохондриальнонаправленных антиоксидантов (рис. 4, 100 нМ) их защитный эффект исчезал и наблюдалось повреждающее действие, связанное, по-видимому, с прооксидантным эффектом.

Важно отметить, что защитный эффект SkQ1 развивался за 2 ч, что соответствовало времени накопления SkQR1 в клетках. В то же время, общий уровень АФК в клетке за это время не снижался. Для предотвращения накопления АФК требовалась значительно более длительная инкубация (7 суток). Можно предполагать, что SkQ1 при кратковременной инкубации нейтрализует АФК в митохондриях (в частности в их внутренней мембране), и именно это определяет его защитное действие, а общий уровень АФК в клетке не столь существенен для изменений морфологии митохондрий.

ИЗУЧЕНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ БЕЛКА DRPПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ Для того, чтобы определить мишень действия АФК при индукции фрагментации митохондрий, мы обратились к механизму дробления. Ключевым белком в этом процессе является динамин-подобный белок Drp1, относящийся к семейству малых ГТФаз. Известно, что в норме он находится в динамическом равновесии между сайтами на внешней мембране митохондрий и цитоплазмой, а в ответ на апоптозные стимулы стабилизируется на митохондриях и образует перетяжку мембран при фрагментации. При окрашивании специфическими антителами к белку Drp1 в контрольных клетках мы обнаружили белок как в цитоплазме клетки, так и в локусах на мембране митохондрий. После обработки клеток пероксидом водорода мы обнаружили, что комплексы на мембране митохондрий увеличились в размере, однако, достоверного увеличения фракции белка, связанной с митохондриями, не наблюдалось. Полученные данные не позволяют нам однозначно оценивать роль белка Drp1 в фрагментации митохондрий при окислительном стрессе. Возможно, в условиях мягкого окислительного стресса дополнительной транслокации Drp1 на митохондрии не происходит, но перестраиваются его предсуществующие комплексы, что способствует фрагментации.

ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСЛОКАЦИИ БЕЛКА BAX ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ Белок BAX является важнейшим компонентом системы индукции апоптоза. В норме он, как и Drp1, располагается в цитоплазме клетки. В ответ на различные проапоптозные стимулы BAX переселяется на внешнюю мембрану митохондрий, затем изменяет конформацию с образованием олигомеров, которые, предположительно, формируют поры для выхода цитохрома С из межмембранного пространства митохондрий.

Мы исследовали распределение BAX в клетке при окислительном стрессе и показали, что уже через два часа после добавки пероксида водорода фракция BAX на митохондриях увеличивается и снижается его содержание в цитоплазме (рис. 5).

Рисунок 5. Активные формы кислорода изменяют распределение белка BAX в клетке.

Клетки HeLa предынкубировали с SkQ1 2 нМ 2 часа, затем обрабатывали пероксидом водорода 250 мкМ 20 часов. Белки BAX и цитохром С визуализировали с использованием антител так, как описано в разделе «Объекты и методы исследования». Бар – мкм.

Перераспределение BAX не сопровождалось выходом цитохрома С из митохондрий в цитоплазму (рис. 5). Это полностью согласуется с отсутствием признаков апоптоза у этих клеток. Для изучения роли митохондриальной продукции АФК в перераспределении BAX мы использовали митохондриально-направленные антиоксиданты. Мы обнаружили, что SkQ1 (20 нМ, 2 часа) эффективно предотвращает транслокацию BAX, вызванную окислительным стрессом (рис. 5).

Антиоксидант общего действия Trolox также обладал защитным действием, но в значительно больших концентрациях (0,1 мМ). Как и в случае фрагментации митохондрий, эффект SkQ1 развивался очень быстро. Следуя логике, приведенной выше, можно полагать, что транслокация ВАХ определяется уровнем АФК, локализованных внутри митохондрий. Этот вывод находится в кажущемся противоречии с представлениями о том, что ВАХ получает сигнал, ведущий к транслокации, находясь в цитоплазме. Дальнейшие эксперименты позволили разрешить это противоречие.

Предполагают, что белок BAX для осуществления своей проапоптозной функции взаимодействует с другими белками в комплексе т.н. «митохондриальной поры».

Одним из белков, участвующих в образовании этого комплекса, является транслокатор адениновых нуклеотидов (ANT). Мы исследовали влияние конформации ANT на транслокацию BAX при окислительном стрессе. Для этого мы использовали ингибиторы ANT, бонгкрековую кислоту и атрактилозид, фиксирующие транслокатор в различных конформациях. Мы обнаружили, что бонгкрековая кислота предотвращает транслокацию BAX на мембрану митохондрий при окислительном стрессе, вызванном пероксидом водорода (рис. 6а).

Атрактилозид, напротив, вызывал транслокацию BAX на мембрану митохондрий в значительной части клеток (рис. 6б). Атрактилозид усиливал действие H2O2 на транслокацию ВАХ, и SkQ1 при этом уже не оказывал значительного защитного эффекта.

А Б Рисунок 6. Конформация транслокатора адениновых нуклеотидов определяет локализацию BAX в клетке.

Белки BAX и цитохром С (cyt c) визуализировали с импользованием антител так, как описано в разделе «Объекты и методы исследования». Бар – 4 мкм. А: Клетки HeLa предынкубировали с бонгкрековой кислотой (10 мкМ) в течение 2 часов, и затем добавляли пероксид водорода (300 мкМ) на 24 часа. Б: Клетки HeLa предынкубировали с SkQ1 (2 нМ, 2 часа) и затем добавляли атрактилозид (100 мкМ) и пероксид водорода (мкМ) на 24 часа.

Итак, мы обнаружили, что конформация транслокатора адениновых нуклеотидов влияет на локализацию BAX в клетке. Поскольку атрактилозид способствует открытию «митохондриальную поры», а бонгкрековая кислота ее закрытию, мы исследовали роль поры в транслокации ВАХ. Для этого мы использовали ингибиторы митохондриальной поры циклоспорин А и его аналог N-метил-4изолейцин-циклоспорин, обладающий более селективным действием. Было показано, что и циклоспорин А и его аналог вызывают частичную транслокацию BAX в клетках контрольной культуры, и не влияют на изменение локализации этого белка при окислительном стрессе. Следовательно, определяющим фактором в транслокации ВАХ является конформация ANT, а не состояние поры. Это вывод согласуется с данными, полученными на частично очищенных препапратах поры, где изменение конформации ANT вызывало изменение сродства ВАХ к комплексу в целом (Vyssokikh et al., 2002). ANT может непосредственно взаимодействовать с ВАХ в составе т. н. «контактных сайтов», а может влиять на связывание его с другими белками комплекса на поверхности митохондрий. Известно, что окисление дитиола на матриксной стороне молекулы АNT может приводить к изменению его конформации, подобно атрактилозиду. Возможно, окислительный стресс вызывает окисление этого дитиола, что и приводит к увеличению сродства АNT к ВАХ и транслокации ВАХ на митохондрии. SkQ1, в таком случае, мог бы предотвращать транслокацию ВАХ, защищая дитиол АNT от окисления.

Мы использовали ингибиторы ANT для изучения возможной взаимосвязи между транслокацией BAX и фрагментацией митохондриального ретикулума при окислительном стрессе. Несмотря на то, что бонгкрековая кислота предотвращала транслокацию BAX, она никак не влияла на фрагментацию митохондрий, вызванную Н2О2. На основании этих данных мы полагаем, что транслокация BAX при окислительном стрессе не является причиной фрагментации митохондриального ретикулума.

ВЛИЯНИЕ БЕЛКА BCL-2 НА МОРФОЛОГИЮ МИТОХОНДРИЙ И ЛОКАЛИЗАЦИЮ BAX ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ Белок Bcl-2 является основным клеточным ингибитором проапоптозной функции BAX. Гиперэкспрессия Bcl-2 характерна для многих опухолей и определяет их резистентность к радио- и химиотерапии. Мы исследовали участие этого белка в фрагментации митохондрий и транслокации BAX на мембрану митохондрий при окислительном стрессе. Мы обнаружили, что в клетках HeLa с гиперэксперссией Bcl-2 структура митохондриального ретикулума изменена по сравнению с контролем. В этих клетках митохондрии более короткие, а около 30 % клеток содержат полностью фрагментированный митохондриальный ретикулум (рис. 7б). В ответ на пероксид водорода эти органеллы фрагментировались значительно интенсивнее, чем в контрольной культуре. Несмотря на это, гиперэксперссия Bcl-эффективно предотвращала гибель клеток, вызванную высокими концентрациями пероксида водорода (рис. 7а). При изучении распределения BAX мы обнаружили, что во многих клетках, гиперэкспрессирующих Bcl-2, BAX локализован на мембране митохондрий (рис. 7в). При обработке пероксидом водорода это распределение становилось общим для всех клеток культуры. Таким образом, мы обнаружили, что несмотря на выраженный антиапоптозный эффект, Bcl-2 не предотвращал ни фрагментацию митохондрий, ни транслокацию BAX, вызванную окислительным стрессом. Это указывает на то, что апоптоз и фрагментация митохондрий являются событиями, не связанными друг с другом причинноследственной связью.

В А Б Рисунок 7. Гиперэкспрессия белка Bcl-2 предотвращает гибель клеток от окислительного стресса, однако, не защищает от фрагментации митохондриального ретикулума и транслокации BAX.

А: Клетки HeLa, контрольные и гиперэкспрессирующие Bcl-2, обрабатывали пероксидом водорода 700 мкМ в течение 20 часов, и затем жизнеспособность клеток оценивали методом CellTiter Blue (Promega) согласно инструкции изготовителя. Б: Клетки HeLa, контрольные и гиперэкспрессирующие Bcl-2, обрабатывали пероксидом водорода 250 мкМ в течение 20 часов. Представлены данные трех независимых экспериментах. В: Клетки HeLa, гиперэкспрессирующие Bcl-2, обрабатывали пероксидом водорода мкМ в течение 20 часов. Белки BAX и цитохром С (cyt С) визуализировали с импользованием антител так, как описано в разделе «Объекты и методы исследования». Бар – 4 мкМ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Исследование нетоксического окислительного стресса в культуре клеток HeLa показало, что в ответ на пероксид водорода в клетках активируется эндогенная продукция активных форм кислорода. Накопление АФК стимулируется ингибитором дыхательной цепи митохондрий миксотиазолом, и ингибируется специфическим митохондриально-направленным антиоксидантом SkQ1. Это говорит о том, что АФК при окислительном стрессе образуются внутри митохондрий.

При окислительном стрессе происходит фрагментация митохондрий, которая усиливается под действием ингибиторов дыхательной цепи, и предотвращается митохондриально-направленными антиоксидантами. Можно предполагать, что АФК, образующиеся в митохондриях в ответ на пероксид водорода, вызывают активацию механизмов, приводящих к фрагментации митохондриального ретикулума.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»