WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

крыса – 11; человек и шимпанзе – 8; бык и собака – 9) (Рис. 2). Один из мономеров у полевки редуцирован и имеет вид W-(X)3. Общая протяженность триптофанового повтора в белке NANOG полевки 64 а.о. Недавние исследования показывают, что W-повтор белка NANOG мыши необходим для трансактивации транскрипции генов-мишеней. Он участвует в димеризации молекул белка NANOG, что необходимо при LIF-независимом поддержании плюрипотентности ЭСК мыши (Mullin et al., 2008). По всей видимости, функциональную роль играют именно остатки триптофана. Замена триптофана на аланин вызывает существенное снижение трансактивационной способности белка NANOG мыши, в то время как замена остальных аминокислот в пределах мономеров W-повтора не вызывает существенного изменения активности (Pan, Pei, 2005). Сравнение аминокислотных последовательностей белков NANOG полевки и шести видов млекопитающих выявило высокую консервативность остатков триптофана по сравненю с остальными аминокислотными остатками в мономерах W-повторов (Рис. 2). Это может служить еще одним доказательством их высокой функциональной значимости. Вариация числа мономеров Wповторов от 13 (полевка) до 9 (бык и собака) у разных видов вероятно не является критической при образовании димеров и проявлении трансактивационных свойств белков NANOG.

Еще одним трансактивационным элементом белка NANOG является Cтерминальный домен 2(CD2) (Wang et al., 2008). Данный элемент необходим для NANOG-опосредованного самообновления ЭСК мыши. Обнаружено, что активность домена CD2 зависит от наличия в нем остатков ароматических аминокислот (фенилаланина и триптофана). Сравнение аминокислотных последовательностей домена CD2 показало, что большинство остатков ароматических аминокислот, играющих определяющую роль в трансактивационной способности CD2 белка NANOG мыши, обладают низкой консервативностью среди млекопитающих и их участие в данном процессе у различных видов следует изучать подробнее.

Рис. 2. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белков NANOG семи видов млекопитающих. Синими линиями выделены: гомеодомен и Wповтор. Красными линиями выделены: C-концевые домены 1(CD1) и 2(CD2). Черными прямоугольниками и цифрами обозначены позиции ароматических аминокислот необходимых для оптимальной трансактивационной активности домена CD2 белка NANOG мыши. * – полностью совпадающие позиции. Mr – M. rossiaemeridionalis, Mm – Mus musculus, Rn – Rattus norvegicus, Hs – Homo sapiens, Pt – Pan troglodytes, Bt – Bos taurus, Cf – Canis familiaris.

6. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевки M. rossiaemeridionalis.

Методом 3’-RACE экспрессия гена Oct4 полевки выявлена в предымплантационном развитии на стадиях морулы, бастоцисты (2,5 – 4,д.п.о.), а также на постимплантационных стадиях развития до 17 д.п.о. (Рис. 3).

Рис. 3. (А) Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в эмбриогенезе полевки M.

rossiaemeridionalis методом 3’-RACE. (Б) Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в линиях клеток примитивной энтодермы полевок (XEN M6), трофобластных стволовых клетках полевок (R1), а также органах взрослых полевок M. rossiaemeridionalis. В качестве положительного контроля реакций обратной транскрипции в ПЦР использовали праймеры на -actin. (ОТ+) реакции с добавлением обратной транскриптазы, (ОТ-) отрицательный контроль. Реакции без обратной транскриптазы.

В предымплантационном эмбриогенезе полевки транскрипция гена Octвпервые выявляется на стадии морулы и продолжается вплоть до стадии бластоцисты. На постимплантацционных стадиях (8,0-17,0 д.п.о.) транскрипция гена Oct4 обнаружена во всех образцах. Экспрессия гена Nanog обнаружена на 2-х клеточной стадии, на стадии морулы и бластоцисты. На постимплантационных стадиях развития эмбрионов полевки экспрессия гена Nanog не детектировалась. По всей видимости, у полевок происходит более ранняя репрессия транскрипции гена Nanog. Возможно, остаточного белка достаточно для первичной специализации герминальных клеток. В органах взрослых полевок (передние доли головного мозга, сердце, тимус, желудок, печень, кишечник, яичники и семенники), помощью метода ОТ-ПЦР транскрипция генов Oct4 и Nanog не обнаружена. В данном случае паттерн экспрессии генов Oct4 и Nanog совпадает с таковым у мыши. В клетках линий R1 и XEN M6 полевки, являющихся производными трофобласта и примитивной энтодермы бластоцист, соответственно, экспрессия Oct4 и Nanog также не обнаружена. Вероятно, у полевки, как и у мыши, экспрессия генов Oct4 и Nanog ограничивается недифференцированными, плюрипотентными клетками.

Следовательно, гены Oct4 и Nanog можно использовать как маркерные гены при получении ЭСК полевок рода Microtus. Наиболее полно в данном направлении можно использовать ген Nanog, поскольку его экспрессия у полевок ограничивается стадиями предымплантационного развития.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данной работе представлены результаты исследований структуры, регуляции и особенностей экспрессии генов Oct4 и Nanog у обыкновенных полевок рода Microtus. Гены Oct4 и Nanog являются одними из основных в системе поддержания плюрипотентности клеток у млекопитающих.

Определена полная нуклеотидная последовательность гена Oct4 полевки M. rossiaemeridionalis размером 4607 п.н. Проведено детальное исследование экзон-интронной организации генов Oct4 и Nanog, сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей данных генов у полевки и шести видов, относящихся к разным отрядам млекопитающих. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов Oct4 полевки M. rossiaemeridionalis и шести видов млекопитающих (мыши, крысы, человека, шимпанзе, быка и собаки) показало высокую консервативность кодирующей последовательности гена OctНаибольший уровень гомологии наблюдается между эволюционно близкими видами: полевкой, мышью и крысой.

Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 5’регуляторных областей ортологичных генов Oct4. Основные функциональные элементы данной области (область минимального промотора, дистальный и проксимальный энхансер) проявляют высокую степень сходства у всех сравниваемых видов млекопитающих. Показано, что наибольшей консервативностью обладают: GC-богатые сайты, потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов семейства Sp, гормончувствительный элемент (HRE), а также авторегуляторный композиционный сайт связывания факторов OCT4 и SOX2. Гомология сайтов транскрипционных факторов MASH2 и PEM низка.

Показано, что последовательность 5’-регуляторной области гена Octпроявляет способность активировать транскрипцию в составе репортерных конструкций в плюрипотентных клетках мыши. Отдельные элементы регуляторной области гена Oct4 полевки проявляют функциональную гомологию с таковыми у мыши. Дистальный энхансер гена Oct4 полевки, как и у мыши, активен в ЭСК.

В ходе работы, определена полная нуклеотидная последовательность гена Nanog полевки M. rossiaemeridionalis размером 7586 п.н., установлена его экзонинтронная структура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов Nanog и шести видов млекопитающих (мыши, крысы, человека, шимпанзе, быка и собаки) выявил более низкий по сравнению с геном Oct4 уровень гомологии (до 77%). Наибольшей гомологией обладают второй и третий экзоны генов Nanog, кодирующие основной функциональный элемент белка NANOG – гомеодомен. Сравнение аминокислотных последовательностей предсказанного белка NANOG полевки и шести видов млекопитающих показало относительно высокий уровень гомологии (85-88%) гомеодомена во всех парах сравниваемых видов. N- и C-трансактивационные домены, а также область W-повтора показали относительно высокий уровень гомологии только между эволюционно близкими видами: полевкой, мышью и крысой. Однако, показано, что остатки ароматических аминокислот в домене CD2 белка NANOG, играющим важную роль в трансактивации генов-мишеней у мыши, обладают низкой консервативностью среди изученных видов.

Исследование экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевки показало, что данные гены в основном сохраняют паттерн экспрессии характерный для мыши, т.е. их экспрессия ограничивается плюрипотентными клетками. Однако, экспрессия гена Nanog, в отличие от мыши, ограничивается предымплантационными стадиями развития эмбриона. Возможно, на стадии бластоцисты, той стадии развития эмбриона, которая используется для получения ЭСК, у полевок, уже происходят процессы связанные с репрессией транскрипции гена Nanog. Снижение уровня транскрипции гена Nanog в свою очередь может критически снижать вероятность получения стабильных линий ЭСК. Вероятно, выходом из данной ситуации может быть использование для получения ЭСК более ранних стадий развития эмбрионов, например, морул.

Описанные в работе данные, позволяют лучше понять особенности функционирования элементов системы поддержания плюрипотентности клеток у млекопитающих и будут полезны при проведении экспериментов по получению ЭСК различных видов млекопитающих.

ВЫВОДЫ 1. Впервые определена нуклеотидная последовательность гена Oct4 полевки M. rossiaemeridionalis размером 4607 п.н. и установлена его структурнофункциональная организация. Ген Oct4 полевки состоит из 5 экзонов и интронов. Размер мРНК равен 1357 н., размер кодируемого белка составляет 354 а.о.

2. Анализ 5’-регуляторной области гена Oct4 полевки, размером 4017 п.н., показал наличие консервативных элементов: GC-богатых сайтов, потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов семейства Sp, гормончувствительного элемента, а также авторегуляторного композиционного сайта связывания факторов OCT4 и SOX2.

3. 5’-регуляторная область гена Oct4 полевки, встроенная в состав репортерных конструкции проявляет активность в плюрипотентных клетках мыши (TG-2a, P19) и неактивна в трофобластных стволовых клетках полевки (R1). Делеция дистального энхансера регуляторной области гена Oct4 полевки существенно снижает активность конструкций в клетках TG-2a и не влияет на нее в клетках линии P19. Делеции и инверсии других элементов регуляторной области также вызывают снижение активности репортерных конструкций в разной степени.

Показана важность ориентации регуляторных элементов в модуляции транскрипции.

4. Впервые определена нуклеотидная последовательность гена Nanog полевки M. rossiaemeridionalis размером 7586 п.н. и его структурнофункциональная организация. Ген Nanog полевки состоит из 4 экзонов и интронов. Размер мРНК составляет 2411 н., размер кодируемого белка составляет 319 а.о. Четвертый экзон гена Nanog полевки содержит протяженную 3’-нетронслируемую область размером 1291 п.н.

5. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белков NANOG полевки и шести видов млекопитающих показал высокий уровень гомологии гомеодоменов данных белков. В последовательности белка NANOG полевки выявлен блок триптофановых повторов, характерный для белков NANOG других видов млекопитающих. Обнаружено, что несколько из остатков ароматических аминокислот, влияющих на трансактивационные свойства домена CD2 белка NANOG мыши, отсутствуют у полевок.

6. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевки M.

rossiaemeridionalis показал, что транскрипция гена Nanog впервые выявляется в 2-х клеточных эмбрионах и ограничивается предымплантационными стадиями развития эмбриона. Транскрипция гена Oct4 впервые выявляется на стадии морулы и продолжается до семнадцатого дня эмбрионального развития. Транскрипция генов Oct4 и Nanog не обнаружена в линиях трофобластных стволовых клеток (R1) и клеток примитивной энтодермы (XEN M6) полевок, а также в восьми органах взрослых полевок (мозге, сердце, тимусе, желудке, печени, кишечнике, яичнике и семеннике). Ген Nanog можно использовать как маркер плюрипотентности клеток полевок.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Medvedev S.P., Shevchenko A.I., Elisaphenko E.A., Nesterova T.B., Brockdorff N., Zakian S.M. Structure and expression pattern of Oct4 gene are conserved in vole Microtus rossiaemeridionalis // BMC Genomics. 2008.

9:162.

2. Медведев С.П., Шевченко А.И., Мазурок Н.А., Закиян С.М. Oct4 и Nanog – ключевые гены в системе поддержания плюрипотентности клеток млекопитающих // Генетика. 2008. Т. 44. № 12. С. 1586-1607.

3. Медведев С.П., Елисафенко Е.А., Шевченко А.И., Мазурок Н.А., Закиян С.М. Молекулярно-генетическая организация и особенности экспрессии гена Nanog у полевки Microtus rossiaemeridionalis // Доклады Академии Наук. 2009. Принята в печать.

4. Шевченко А.И., Медведев С.П., Мазурок Н.А., Закиян С.М.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки // Генетика. 2009. Т.

45. № 2. Принята в печать.

5. Медведев С.П., Шевченко А.И., Елисафенко Е.А. Характеристика структуры и экспрессии гена Oct4 полевки Microtus rossiaemeridionalis // Материалы Международной Конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 28 июня – 2 июля 2006 г.), стр. 123.

6. Медведев С.П., Шевченко А.И., Елисафенко Е.А., Закиян С. М.

Oct4 и Nanog – ключевые гены в системе поддержания плюрипотентности клеток млекопитающих // Материалы Международной Молодежной Научно-Методической Конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 9 – 12 мая 2007 г.), стр. 118-119.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»