WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Для получения репортерной конструкции, содержащей дистальный энхансер гена Oct4 полевки, (pDE2) фрагмент регуляторной области (–2186/– 1895) клонирован в вектор pGL2-Basic (Promega) по сайтам Bgl II-Hind III в 5’область гена люциферазы. Для получения конструкции, содержащей все элементы регуляторной области, в плазмиду pDE2 по сайту Hind III клонирован фрагмент (–1895/+106), содержащий проксимальный энхансер и промотерную область гена Oct4 полевки (конструкция pDEH6). Фрагмент (–1895/+106) клонирован в pDE2 также в противоположенной ориентации (конструкция pDEH7). Кроме того, фрагмент (–1895/+106) клонирован отдельно в вектор pGL2-Basic в обеих ориентациях по отношению к гену люциферазы (конструкции pDE1 и pDE2, соответственно). В результате гидролиза плазмиды pDEH6 эндонуклеазой рестрикции Kpn I и последующего лигирования получена конструкция pDEH6K4, несущая делецию сайта 1А проксимального энхансера. Плазмида pDEH6S7, содержащая исключительно промоторную область (–603/+106) гена Oct4 полевки, получена в результате гидролиза плазмиды pDEH6 эндонуклеазой рестрикции Sma I.

Для транфекции клеток использовали Lipofectamin2000 (Invitrogen), трансфекцию проводили согласно прилагающейся к реагенту инструкции. Для детекции люциферазной активности использовали Luciferase Assay System (Promega).Для измерения люциферазной активности использовали биолюминометр ЛБ-3ПА.

4. Контекстный анализ последовательностей ДНК.

Компьютерный анализ последовательностей ДНК выполнен с помощью пакетов программ BLAST (Altschul et al., 1990), FASTA (Pearson, Lipman, 1988), DNASTAR (DNASTAR Inc.). Выравнивание последовательности нуклеотидов производилось при помощи программы Pip Maker (http:\\www.bio.cse.psu.edu), LALIGN из пакета программ FASTA, CLUSTAL X 1.81, для оценки статистической значимости гомологии двух последовательностей - программа RSS из пакета FASTA. Для выявления повторяющиxся элементов использовалась база данныx повторов в геномаx человека и грызунов RepBase (Jurka, 1995), программа RepeatMasker (http://www.repeatmasker.org/cgibin/WEBRepeatMasker).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование нуклеотидной последовательности и экзон-интронной структуры гена Oct4 полевки M. rossiaemeridionalis.

Геномная последовательность Oct4 полевки выделена в результате скрининга геномной фаговой библиотеки полевки M. rossiaemeridionalis построенной на основе вектора Lamda DASH II (Nesterova et al., 2001).

Определена последовательность встройки фага размером 10315 п.н., в составе которых, на основании гомологии с последовательностью гена Oct4 мыши, выявлены 5 экзонов, 4 интрона и регуляторная область гена Oct4. В пределах 5’регуляторной области, общей протяженностью 4017 п.н., выявлены минимальный промотор, проксимальный и дистальный энхансеры.

Последовательности, расположенные за пятым экзоном гена Oct4, которые секвенированы лишь частично, имеют область гомологии, размером 856 п.н. с 3’-областью и четвертым экзоном гена Tcf19 мыши. Наличие в 3’-области гена Oct4 полевки последовательностей, гомологичных гену Tcf19 мыши, указавает на то, что у полевки, по-видимому, сохраняется синтенная группа, обнаруженая у всех исследованных видов млекопитающих (Yeom et al., 1991;Takeda et al., 1992; van Eijk et al., 1999; Shi et al., 2007). С использованием программы RepeatMasker полученная последовательность проанализирована на предмет наличия повторяющихся элементов. В интронах и 5’ и 3’ области гена Octполевки выявлены повторяющиеся последовательности ДНК. Основную их массу составляют SINE элементы. Совокупная доля повторов Alu/B1 и B2-B4 в полученной последовательности гена Oct4 и его регуляторной области составляет 16,24 %.

Для определения экзон-интронных границ и границ транскрипции гена Oct4 полевки проведены 3’- и 5’-RACE эксперименты. Выявленный транскрипт гена Oct4 полевки имеет длину 1357 нуклеотидов и кодирует белок размером а.о.. На 5’-UTR приходится 71 п.н., на 3’-UTR – 224 п.н. Точка старта транскрипции Oct4 у полевки, по сравнению с мышью, располагается на 23 п.н.

раньше и приходится на инсерцию 8 п.н., характерную для минимального промотора полевки. Сигнал полиаденилирования Oct4 полевки имеет видоспецифическую последовательность, 3’ граница гена, по сравнению с геном мыши, располагается на 7 п.н. раньше. Продуктов альтернативного сплайсинга гена Oct4 полевки не обнаружено.

2. Сравнительный анализ ортологичных последовательностей гена Octмлекопитающих.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов Octсеми видов млекопитающих (полевки, мыши, крысы, человека, шимпанзе, быка и собаки), проведенный с помощью программы PipMaker, показал наличие высокого уровня гомологии в экзонах генов Oct4. Наибольшее среднее значение гомологии кодирующей части гена Oct4 полевки наблюдается с мышью и крысой, наименьшее – с собакой. Высокий уровень гомологии (75-95%) характерен в основном только для экзонов. В интронах, 5’ и 3’ области гомология ниже (55-70%), особенно в участках, где локализуются видоспецифические мобильные элементы. При сравнении аминокислотной последовательности гена Oct4 на высоком уровне во всех парах сравниваемых видов сохраняется сходство POU-домена (Таб. 1).

Таблица 1. Гомология (%) нуклеотидных/аминокислотных последовательностей кодирующих частей генов Oct4 полевки и шести видов млекопитающих.

Номера экзонов Пары Гомология в Среднее значение сравниваемых области POUгомологии видов домена 1 2 3 4 83/ 95/ 91/ 86/ 79/ Mr/Mm 87/ 80 90/80 95 97 81 84/ 95/ 92/ 88/ 84/ Mr/Rn 89/ 87 91/82 95 97 84 80/ 87/ 87/ 83/ 71/ Mr/Hs 83/ 85 87/80 92 97 90 79/ 86/ 87/ 79/ 83/ Mr/Pt 82/ 83 86/78 90 95 86 75/ 85/ 88/ 87/ 70/ Mr/Bt 81/ 82 88/72 90 97 94 75/ 85/ 87/ 88/ 81/ Mr/Cf 81/ 80 88/70 90 97 92 Примечания. Mr – M. rossiaemeridionalis, Mm – Mus musculus, Rn – Rattus norvegicus, Hs – Homo sapiens, Pt – Pan troglodytes, Bt – Bos taurus, Cf – Canis familiaris.

5’-регуляторная область гена Oct4 была исследована на предмет наличия консервативных элементов, которые могут быть задействованы в регуляции экспрессии гена Oct4. Филогенетический футпринт промоторной области выявил, что наиболее консервативными в ней являются потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов семейства Sp и гормончувствительный элемент, которые сохраняют высокое сходство и устойчивое расположение друг относительно друга. Гомология остальных элементов регуляторной области гена Oct4 существенно варьирует. Наблюдается высокая гомология GC-богатых мотивов и авторегуляторного Oct4/Sox2 сайта, в то время как гомология сайтов связывания транскрипционных факторов MASH-2 и PEM довольно ограничена.

Этот факт может говорить о том, что основную функцию в регуляции гена Octиграют именно GC-богатые мотивы и авторегуляторный сайт OCT4/SOX2.

3. Анализ активности промотора гена Oct4 полевки.

Проведена временная трансфекция люциферазных репортерных векторов, содержащих различные элементы 5’-регуляторной области гена Oct4 полевки, в эмбриональные стволовые клетки мыши линии TG-2a, клетки эмбриональной карциномы мыши P19 и трофобластные стволовые клетки полевки линии R(Рис. 1). Наибольшую люциферазную активность (превышающую фоновый уровень в ~8 раз) в плюрипотентных клетках линии TG-2a мыши показал клон pDEH6, содержащий промотор и оба энхансера (-2186/+106) в прямой ориентации по отношению к гену люциферазы. Таким образом, показано, что полноразмерная регуляторная область гена Oct4 полевки проявляет высокую активность в плюрипотентных клетках мыши. В плюрипотентных клетках эмбриональной карциномы линии P19, высокую активность, практически равную pDEH6, показал клон pDE1 (-1895/+106), дистальный энхансер в котором делетирован. Однако в эмбриональных стволовых клетках активность данной конструкции была выше фоновой лишь в 1,5 раза (Рис. 1). Этот результат согласуется с данными полученными при исследовании активности различных элементов регуляторной области гена Oct4 мыши. Дистальный энхансер гена Octмыши неактивен в ЭСК и активен в клетках линии P19. По-видимому, у полевки данный элемент имеет сходную с мышью схему активности.

Наименьшую активность, сравнимую с фоновой, показали конструкции pDEH7 и pDE2. В клоне pDEH7 промотор и проксимальный энхансер находятся в обратной ориентации по отношению к гену, а в клоне pDE2 данная область (1895/+106) делетирована. Таким образом, для активации транскрипции осуществляемой регуляторной областью гена Oct4 неоходима его прямая ориентация по отношению к гену. Клон pDEH6K4, содержащий делецию сайта 1А проксимального энхансера, также показал низкую активность в клетках TG-2a и P19 (в ~2 и ~3 раза выше фоновой в TG-2a и P19, соответственно). Активность конструкции pDEH6S7, содержащей только промотор гена Oct4 (-603/+106), также была выше фона в ~3 раза. Таким образом, для оптимальной активации транскрипции не достаточно наличия промоторной области и энхансерные элементы вносят значительный вклад в его активацию. При трансфекции клеток линии R1 наблюдали низкий, сравнимый с фоновым, уровень люциферазной активности во всех вариантах конструкций (Рис. 1). По всей видимости, только в плюрипотентных клетках существует сбалансированный, и достаточный набор факторов, участвующих в активации гена Oct4, как у мыши так и у полевки.

Люциферазная активность Рис. 1. Анализ активности люциферазных репортерных конструкций содержащих различные элементы регуляторной области гена Oct4 полевки в линиях клеток TG-2a, P19 и R1. PP – проксимальный промотор; PE (1A) (1B) – проксимальный энхансер, сайты 1A и 1B; DE (2A) – дистальный энхансер, сайт 2A.

В качестве негативного контроля трансфекции и определения фонового уровня люминесценции использовали плазмиду pGL2-Basic без встройки (Рис.

1).

4. Исследование нуклеотидной последовательности и экзон-интронной структуры гена Nanog полевки M. rossiaemeridionalis.

Для получения геномной последовательности гена Nanog полевки проводили ПЦР с праймерами NanogLF и Nanog-3UTR_R2. ПЦР-продукт размером 7026 п.н. секвенирован с помощью генспецифических праймеров. К полученной последовательности была добавлена последовательность 3’-области кДНК гена Nanog полевки, определенная после секвенирования продуктов 3’RACE. В итоговой последовательности размером 7849 п.н. на основании гомологии с последовательностью гена Nanog мыши выявлены последовательности, соответствующие 4 экзонам и 3 интронам гена Nanog.

Повторяющиеся последовательности ДНК в гене Nanog представлены исключительно SINE элементами. Доля данных элементов (Alu/B1, B2-B4, ID) в изученной последовательности составляет 36,07%. SINE элементы обнаружены во всех трех интронах и 3’-UTR гена Nanog полевки.

Для определения экзон-интронных границ и границ транскрипции гена Nanog полевки использованы ОТ-ПЦР и 3’-RACE эксперименты. В качестве источника РНК использовали бластоцисты M. rossiaemeridionalis. Сравнение клонов кДНК, полученных в результате RACE, с геномной последовательностью позволило подтвердить наличие в гене Nanog четырех экзонов, соответствующих экзонам Nanog других исследованных видов млекопитающих.

Выявленный размер транскрипта гена Nanog составляет 2411 н. предполагаемый размер белка NANOG полевки 319 а.о. Транскрипт гена Nanog полевки имеет протяженную 3’-UTR, размером 1291 п.н., содержащею блок SINE элементов.

Альтернативных вариантов сплайсинга гена Nanog полевки не обнаружено.

5. Сравнительный анализ ортологичных последовательностей гена Nanog млекопитающих.

Проведен, сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ортологичных генов Nanog и аминокислотных последовательностей белков NANOG семи видов млекопитающих (полевки, мыши, крысы, человека, шимпанзе, быка и собаки). Числовые значения гомологии представлены в таблице 2. Наибольшим уровнем гомологии обладают второй и третий экзоны.

Первый экзон проявляет низкий уровень гомологии. Четвертый экзон гомологичен лишь частично, основную его часть составляет 3’-UTR, содержащая видоспецифичные SINE элементы. В интронах генов Nanog гомология крайне низка, что, по всей видимости, также связано с большим содержанием SINE элементов.

Таблица 2. Гомология (%) нуклеотидных/аминокислотных последовательностей кодирующих частей генов Nanog полевки и шести видов млекопитающих Номера экзонов Среднее значение Пары гомологии сравниваемых 1 2 3 видов Mr/Mm 60/54 80/64 82/76 54/64 60/Mr/Rn 65/60 80/65 86/83 57/69 77/Mr/Hs 54/49 71/64 82/79 48/57 66/Mr/Pt 53/49 70/64 82/79 48/56 66/Mr/Bt 48/47 68/64 84/76 42/56 63/Mr/Cf 46/43 68/61 78/72 47/48 65/Примечания. Mr – M. rossiaemeridionalis, Mm – Mus musculus, Rn – Rattus norvegicus, Hs – Homo sapiens, Pt – Pan troglodytes, Bt – Bos taurus, Cf – Canis familiaris.

Проведено детальное сравнение функциональных элементов белка NANOG полевки и шести видов млекопитающих. В анализ были включены аминокислотные последовательности гомеодоменов, CD2-терминальных трансактивационных доменов и W-повторов белков NANOG семи видов млекопитающих, включая полевку. Числовые значения гомологии аминокислотных последовательностей функциональных доменов белка NANOG семи видов млекопитающих представлены в таблице 3.

Таблица 3. Гомология (%) аминокислотных последовательностей функциональных элементов белков NANOG полевки и шести видов млекопитающих.

Гомология Пары Гомология Гомология Гомология CD2сравниваемых N-терминального гомеодомена W-повтора терминального видов домена домена Mr/Mm 86,66 48,48 75,00 62,Mr/Rn 88,33 51,51 84,61 68,Mr/Hs 86,66 42,85 59,57 50,Mr/Pt 86,66 42,85 59.57 49,Mr/Bt 88,33 38,82 59,57 45,Mr/Cf 85,00 40,74 55,31 40,Примечания. Mr – M. rossiaemeridionalis, Mm – Mus musculus, Rn – Rattus norvegicus, Hs – Homo sapiens, Pt – Pan troglodytes, Bt – Bos taurus, Cf – Canis familiaris.

В белке NANOG полевки обнаружено самое большое среди проанализированных последовательностей белков NANOG семи видов млекопитающих число мономеров данного повтора – тринадцать (мышь –10;

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»