WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Медведев Сергей Петрович СТРУКТУРА, РЕГУЛЯЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ Oct4 И Nanog У ОБЫКНОВЕННЫХ ПОЛЕВОК РОДА MICROTUS (ARVICOLINAE, RODENTIA) Генетика – 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2009

Работа выполнена в лаборатории эпигенетики развития Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Сурен Минасович Закиян Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Александр Владимирович Таранин доктор биологических наук, профессор Людмила Васильевна Высоцкая Ведущее учреждение: Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, г. Москва

Защита состоится «»_200 г. на утреннем заседании Диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) при Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10. Факс: (383) 333-12-78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН.

Автореферат разослан «»_200 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев ВВЕДЕНИЕ Актуальность.

Получение и исследование эмбриональных стволовых клеток различных видов млекопитающих является одной из актуальных проблем современной биологии. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) получают из внутренней клеточной массы (ВКМ) либо эпибласта предымплантационных эмбрионов млекопитающих. Одно из основных уникальных свойств ЭСК – плюрипотентность. Плюрипотентность определяет способность ЭСК дифференцироваться, in vivo и in vitro, в производные всех трех зародышевых листков, эктодермы, энтодермы и мезодермы, а также образовывать во время эмбрионального развития клетки предшественники функциональных гамет (Boiani, Sholer, 2005).

На сегодняшний день известно, что поддержание плюрипотентного статуса клеток предымплантационных эмбрионов и ЭСК обеспечивается сложной системой клеточно-поверхностных белков, их молекулярных сигнальных путей (подсистема «внешних регуляторов плюрипотентности») и транскрипционных факторов инициирующих или модулирующих транскрипцию генов-мишеней (подсистема «внутренних регуляторов плюрипотентности»).

Подсистема, так называемых «внешних регуляторов плюрипотентности», включает в себя несколько сигнальных путей, основными из которых являются каскады, запускаемые белками LIF, BMP4 и WNT. Действие данных сигнальных путей происходит in vitro, осит видоспецифичный характер. Одни и те же молекулы могут поддерживать плюрипотентность ЭСК мыши и не влиять на плюрипотентность ЭСК человека. Более того, одни и те же пути могут иметь противоположное влияние на ЭСК мыши и человека (Xu et al., 2002; Humphrey et al., 2004; Sumi et al., 2004; Boiani, Sholer, 2005).

Другой подсистемой, регулирующей плюрипотентность ЭСК, является подсистема «внутренних регуляторов плюрипотентности» – транскрипционных факторов, действующих в ядрах клеток. К числу ключевых регуляторов в данной подсистеме относятся транскрипционные факторы OCT4 и NANOG. Данные факторы участвуют в поддержании плюрипотентности клеток как in vivo так и in vitro. Эмбрионы мыши, гомозиготные по нокауту генов Oct4 и Nanog, гибнут в периимплантоционный период развития вследствие недоразвития ВКМ и эпибласта, соответственно (Nichols et al., 1998; Chambers et al., 2003; Mitsui et al., 2003). Подавление экспрессии генов Oct4 и Nanog в ЭСК мыши и человека вызывает дифференцировку клеток в трофобластные производные и производные примитивной энтодермы и мезодермы, соответственно (Niwa et al., 2000; Vekey, O’Shea, 2003; Hay et al., 2004; Hyslop et al., 2005). Совместно с транскрипционным фактором SOX2 они образуют единую систему регуляции транскрипции генов в ЭСК. Взаимодействие этих факторов приводит к формированию двух регуляторных подсистем: авторегуляторной и подсистемы прямой регуляции широкого спектра генов мишеней, большинство из которых участвует в процессах дифференцировки ЭСК (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Геномная организация, экспрессия и регуляция генов, кодирующих факторы OCT4 и NANOG, подробно исследованы только у человека и мыши – видов, для которых получены стабильные линии ЭСК (Chambers, Smith, 2004).

Получение линий ЭСК других видов млекопитающих представляет на сегодняшний день серьезную проблему. Открытым остается вопрос о причинах высокой разницы в эффективности получения плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток у различных видов млекопитающих. Некоторые экспериментальные данные говорят о том, что отрицательный результат экспериментов по получению стабильных линий ЭСК может быть следствием видоспецифичных особенностей регуляции и экспрессии генов системы поддержания плюрипотентности, таких как Oct4 и Nanog (Buehr et al., 2003).

Исследование структуры, регуляции и экспрессии генов, кодирующих транскрипционные факторы OCT4 и NANOG у различных видов млекопитающих важно для формирования представлений о функционировании системы поддержания плюрипотентности в целом и особенностях данной системы у каждого вида в отдельности. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей регуляторных и кодирующих частей генов Oct4 и Nanog млекопитающих позволяет выявить наиболее эволюционно консервативные последовательности, несущие функциональную нагрузку. Кроме того, сравнение нуклеотидных последовательностей и паттерна экспрессии генов Oct4 и Nanog у различных видов млекопитающих позволяет проследить отличия, которые могут являться причиной неудач при получении ЭСК.

Обыкновенные полевки рода Microtus являются модельным объектом для которого ведутся работы по получению ЭСК (Nesterova et al., 2001; Шевченко и др., 2006). Использование стандартных протоколов получения ЭСК мыши и человека на полевках не привели к получению стабильных, плюрипотентных ЭСК. Исследование молекулярно-генетических особенностей структуры генов Oct4 и Nanog, их регуляции и экспрессии у полевок может способствовать выявлению видоспецифических особенностей подсистемы «внутренних регуляторов плюрипотентности» и разработке оптимальной стратегии исследования характеристик «генов плюрипотентности», критичных для получения ЭСК. Полученные знания позволят составить модифицированные, более эффективные, протоколы получения эмбриональных стволовых клеток для видов млекопитающих, получение ЭСК у которых затруднено.

Цель и задачи исследования. Цель работы – исследовать структуру, регуляцию и особенности экспрессии генов Oct4 и Nanog у обыкновенных полевок рода Microtus. В конкретные задачи работы входило:

1. Определить последовательность нуклеотидов кодирующих и регуляторных частей генов Oct4 и Nanog полевки M. rossiaemeridionalis.

2. Произвести анализ полученных нуклеотидных последовательностей и сравнение нуклеотидных последовательностей генов Oct4 и Nanog полевки с ортологами этих генов у других видов млекопитающих.

3. Исследовать экспрессию мРНК генов Oct4 и Nanog в онтогенезе полевки.

4. Построить репортерные конструкции, содержащие ген люциферазы под контролем различных элементов регуляторной области гена Oct4, и исследовать активность данных конструкций в линиях плюрипотентных и неплюрипотентных клеток.

Научная новизна.

1. Впервые получены геномные нуклеотидные последовательности генов Oct4 и Nanog полевки M. rossiaemeridionalis. Установлена их экзон-интронная структура. Для гена Oct4 установлена нуклеотидная последовательность регуляторной области, размером 4017 п.н. Геномные нуклеотидные последовательности и последовательности кДНК генов Oct4 и Nanog полевки M. rossiaemeridionalis зарегистрированы в базе данных GeneBank под номерами: Oct4 (EF032593 и EF030115, соответственно); Nanog (EU908043 и EU908044, соответственно).

2. В данной работе впервые исследована экспрессия генов Oct4 и Nanog в онтогенезе и отдельных органах полевки M. rossiaemeridionalis. Показаны сходства и отличия в паттерне экспрессии генов Oct4 и Nanog в онтогенезе мыши и полевки.

3. Впервые исследована активность репортерных конструкций, содержащих различные части регуляторной области гена Oct4 полевки в линиях плюрипотентных клеток мыши и трофобластных стволовых клетках полевки.

Показано, что регуляторная область гена Oct4 полевки активна в клетках мыши и неактивна в неплюрипотентных клетках полевки.

Положения выносимые на защиту.

1. Молекулярно-генетическая организация, регуляция и экспрессия гена Octобладают высокой эволюционной консервативностью.

2. Молекулярно-генетическая организация гена Nanog полевки сходна с таковой у мыши. Однако, существуют отличия на уровне аминокислотных последовательностей функционального домена CD2. Обнаружено, что несколько из остатков ароматических аминокислот, влияющих на трансактивационные свойства домена CD2 белка NANOG мыши, отсутствуют у полевок. Паттерн экспрессии гена Nanog полевки и мыши различаются, в отличие от гена Nanog мыши, он не экспрессируется на постымпланационных стадиях развития эмбрионов.

Практическая значимость.

Результаты данной работы расширяют знания о генах Oct4 и Nanog как отдельных элементов системы поддержания плюрипотентности клеток у млекопитающих и могут быть использованы при планировании и проведении экспериментов по получению ЭСК.

Апробация работы.

Результаты работы представлены в материалах международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 28 июня – 2 июля, 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 9 – 12 мая 2007 г.).

По теме диссертации опубликованы две работы. Одна – в рецензируемом зарубежном журнале, другая – в рецензируемом отечественном журнале. Еще две стать приняты в печать, в рецензируемые отечественные журналы Вклад автора.

Основные результаты получены автором самостоятельно. Скрининг фаговой геномной библиотеки полевки M. rossiaemeridionalis проводился совместно с к.б.н. А.И. Шевченко, анализ нуклеотидных последовательностей генов Oct4 и Nanog проводился совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, 3-х глав, выводов и списка литературы (134 наименований). Работа изложена на 116 страницах, содержит 12 рисунков и 15 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1._Скрининг фаговой геномной библиотеки и молекулярные методы работы.

Геномная библиотека полевки M. rossiaemeridionalis (Nesterova et al., 2001) построенная на основе фагового вектора Lamda DASH II (Stratagene), скринирована в соответствии со стандартной методикой (Sambrook et al., 1989).

Зондом для скрининга служил ПЦР-продукт размером 631 п.н., полученный с использованием в качестве матрицы геномной ДНК полевки и праймеров: Oct2F 5’-ccaagctgctgaagcagaaga-3’ и Oct5R 5’-tttgaatgcatgggagagccca-3’. Выделение ДНК фагов проводили согласно методу описанному Забаровским и Туриной с некоторыми модификациями (Забаровский, Турина, 1998). Все методы, связанные с работой с рекомбинантной ДНК (выделение плазмидной ДНК, расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции, лигирование, субклонирование фрагментов ДНК, ПЦР) выполнялись согласно руководству Sambrook et al., 1989.

Амплификацию гена Nanog осуществляли с помощью набора реагентов Expand Long Template PCR System (Roche). Реакцию проводили в объеме 50 мкл, с использованием буфера 3. Программа: 94°C – 2 мин., 10 циклов: 94°C – 10 сек., 58°C – 30 сек., 68°C – 8 мин.; 25 циклов: 94°C – 15 сек., 58°C – 30 сек., 68°C – мин (+20 сек. каждый цикл). Финальная элонгация – 8 мин. Праимеры использованные для амплификации гена Nanog:

NanogLF: 5-ctgggtcaccttacagcttcttttgcattacaatg-3;

Nanog-3UTR_R2: 5’- aggattggggtgggtaagtgtgtgtgaatgtgggg-3’.

Определение нуклеотидной последовательности проводили согласно протоколу ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Perkin-Elmer Corporation).

2. Работа с РНК, ОТ-ПЦР, 3’- и 5’-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) эксперименты.

РНК из предымплантационных эмбрионов полевок выделяли с помощью TRI REAGENT (Sigma). РНК из клеточных культур (R1, XEN M6) и органов взрослых полевок (передних долей головного мозга, сердца, тимуса, желудка, печени, кишечника, яичников и семенников) выделяли с помощью RNA-Bee (Biogenesis), согласно прилагаемым рекомендациям. Для очистки образцов РНК от контаминаций ДНК использовали набор реагентов TURBO DNA-free (Ambion). Реакции обратной транскрипции проводили при помощи обратной транскриптазы M-MLV (Promega) и случайных праймеров Random-Decamer (Ambion), согласно рекомендациям фирм производителей. Полученная кДНК затем амплифицировалась при помощи ПЦР. Для амплификации использовались следующие праймеры:

Oct4 (5’-ccaagctgctgaagcagaaga-3’; 5’-tttgaatgcatgggagagccca-3’), Nanog (5’-acctcagcctccagcagatgcaag-3’; 5’-aaggcttgtggggtgctaaaatg-3’), -actin (5’-gacggggtcacccacactgt-3’; 5’-gagtacttgcgctcaggaggag-3’).

Для проведения RACE экспериментов использовали BD SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech).

Генспецифические праймеры, использованные в RACE экспериментах:

oct4_3'RACE1: 5’-ctggagaagtgggtggaggaagccgacaa-3’; oct4_5'RACE2: 5’ggttccccctcacgccgttctcaat-3’; nanog-3'RACE1: 5’-gcagccagacctggaccaaccctac-3’;

-actin: 5’-gatatcgctgcgctggtcgt-3’ и 5’-agatcttctccatgtcgtcc-3’.

3. Конструирование репортерных векторов. Временная трансфекция и измерение активности люциферазы.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»