WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Эти данные свидетельствуют о том, что действие дуоденазы на тучные клетки может реализоваться через рецептор PAR1. Мы предположили, что дуоденаза работает подобно катепсину G, как агонист/антагонист (терминатор) рецептора. В следующих экспериментах было показано, что предварительная инкубация тучных клеток с катепсином G (4мкМ) - антагонистом рецептора PAR1, или дуоденазой (8 нМ) отменяла защитный противовоспалительный эффект АРС (0.5 нМ) на тучные клетки (Рис.8).

Еще одно подтверждение действия дуоденазы на клетки, как антагониста PAR1, получено в экспериментах по влиянию дуоденазы на агрегацию тромбоцитов, индуцированную пептидом PAR1-AP. Показано, что дуоденаза (16 и 160 нМ) снижала вызванную PAR1-AP (30-100мкМ) агрегацию тромбоцитов.

Таким образом, рецептором АРС на тучных клетках служит PAR1 и он же является рецептором дуоденазы, которая может работать подобно катепсину G – как агонист/антагонист рецептора.

Вклад NО в действие АРС на секреторную активность тучных клеток Показано, что обнаруженное нами снижение секреции -гексозаминидазы под действием АРС обусловлено освобождением тучными клетками эндогенного NO, т.к. предобработка (30 минут) тучных клеток 300 мкМ LNAME до добавления АРС (0.5-2.5нМ) приводила к достоверному повышению в 1.5 раза секреции -гексозаминидазы относительно уровня секреции в присутствии АРС (P<0.01, n=4) (Рис. 9).

Вызванное АРС снижение секреции медиатора тучными клетками, обработанными дегранулятором - веществом 48/80, также как обусловлено освобождением ими NO, т.к. предварительная инкубация клеток с L-NAME отменяла эффект снижения секреции -гексозаминидазы под действием АРС на активированные веществом 48/80 тучные клетки (Рис. 9).

Рис. 9. Предварительная инкубация тучных клеток с L-NAME (300мкМ) отменяет действие АРС на клетки. Слева – спонтанноактивированные клетки, справа – клетки, активированные веществом 48/80. Черные столбцы - действие АРС, белые - прединкубация клеток с L-NAME и последующее действие АРС (*Р<0.05, **Р<0.01 по отношению к контролю, n=4).

О вкладе NO в вызванную АРС регуляцию секреции медиаторов тучными клетками свидетельствуют результаты экспериментов с клетками, полученными от животных контрольной группы (к опыту с острым воспалением), получавших кетотифен (см. выше), который блокирует освобождение оксида азота (Eliakim et al., 1995). У этих тучных клеток АРС (в эффективных протекторных концентрациях (0.5-1nM)) не вызвал изменений в секреции -гексозаминидазы.

По-видимому, АРС, подобно тромбину (Strukova еt аl., 1999), может вызывать аутокринную регуляцию освобождения NO тучными клетками.

Наши данные подтверждают предположение о том, что рецепторы PAR на клетках-мишенях служат сенсорами протеиназ и вовлекаются в сопряжение процессов свертывания крови и воспаления (Strukova, 2006).

4. Влияние АРС на процесс заживления экспериментальной язвы желудка у крыс Недавно показано, что АРС стимулирует пролиферацию клеток в культуре кератиноцитов [Xue et al., 2005], вызывает ускорение заживления кожных ран у крыс, стимулируя ангиогенез, реэпителизацию и ингибируя воспаление [Jackson et al., 2005] и блокирует воспалительные ответы слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки у экспериментальных животных [Isobe et al., 2004].

Наши эксперименты показали, что АРС, подобно пептиду-агонисту PAR(PAR1-AP), при однократном внутрижелудочном введении может ускорять заживление экспериментальной язвы желудка. Анализ образцов ткани желудка в очаге язвообразования на 3 сутки после операции показал, что у животных опытной группы, которым вводили АРС уже на 3 сутки эксперимента воспалительная реакция и отек были менее выражены по сравнению с контролем. Наблюдалось увеличение клеток с признаками фибробластической дифференцировки, что свидетельствует об ускоренном созревании предшественников фибробластов, мигрирующих в раневую зону. У животных, которым вводили АРС, содержание нейтрофилов было в 2 раза ниже, а фибробластов более чем в 1.5 раза выше, чем в контроле (Р<0.05, n=3).

На 7 день после операции в грануляционной ткани животных, которым вводили АРС, преобладали четко ориентированные фибробластические элементы. Количество нейтрофилов было снижено в 2.3 раза, а количество фибробластов увеличено в 1.5 раза по сравнению с контролем (Р<0.05, n=3) (Рис. 10).

Рис. 10. Морфологические изменения подслизистой оболочки желудка на 3 (слева) и (справа) сутки эксперимента (гематоксилин, эозин, ув. х400). Вверху - опытная (АРС), внизу – контрольная группа. Диаграммы отражают клеточный состав подслизистой оболочки желудка на 3 (слева) и 7 (справа) сутки эксперимента. Черные столбцы – физ. раствор (n=3), белые – АРС (n=3), *Р<0.05 по сравнению с контролем.

Таким образом, на модели экспериментальной ацетатной язвы желудка показано, что АРС при однократном внутрижелудочном введении блокирует воспалительные ответы, сокращая фазу воспаления и сдвигая фазу пролиферации на более ранние сроки, что приводит к ускорению заживления язвы желудка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, установлено, что активированный протеин С может регулировать активность тучных клеток. В модели спонтанной и вызванной активации перитонеальных тучных клеток крысы (iv vitro) показано, что АРС дозозависимо в узком диапазоне низких концентраций (нМ) блокирует секрецию медиаторов воспаления тучными клетками. Действие АРС на тучные клетки реализуется через активацию PAR1, поскольку десенситизация тромбиновых PAR1 рецепторов на тучных клетках отменяет вызванное APC снижение секреции -гексозаминидазы. О действии АРС через расщепляемые рецепторы PAR свидетельствуют данные о том, что инактивированный PMSF APC, лишенный протеолитической активности, не имитирует действие фермента. Показана высокая специфичность активации PAR1 тучных клеток APC (EC50=0.19нМ). Установлено, что противовоспалительное действие низких концентраций АРС на тучные клетки, обусловлено усилением генерации NO, о чем свидетельствует отмена защитного действия АРС в присутствии L-NAME - ингибитора образования NO. Показано, что действие низких концентраций АРС на тучные клетки блокируют эндогенные протеиназы: катепсин G и протеиназа желудочно-кишечного тракта – дуоденаза, которая активирует тучные клетки через рецепторы PAR1.

На модели острого экспериментального воспаления у крыс обнаружено появление в перитонеальной полости сериновых протеиназ – АРС и тромбина, и выявлен противовоспалительный ответ перитонеальных тучных клеток, полученных от животных с острым перитонитом на низкие (пМ-нМ) концентрации АРС. Обнаружено, что при экспериментальной ацетатной язве желудка у крыс АРС, введенный однократно, сокращает фазу воспаления и сдвигает фазу пролиферации на более ранние сроки, что приводит к ускорению заживления язвы желудка.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о новой функции АРС - регуляции активности тучных клеток, что существенно расширяет представления о противовоспалительных свойствах АРС.

ВЫВОДЫ 1. На модели острого экспериментального перитонита у крыс установлено, что индукция воспаления сопровождается появлением в перитонеальной полости тромбина и АРС. Максимальная концентрация тромбина наблюдается на 10-й минуте, АРС - на 120-й минуте воспаления.

Перитонеальные тучные клетки, полученные от животных с острым воспалением, отвечают на низкие концентрации АРС (0.05–10нМ) снижением секреции -гексозаминидазы.

2. Показано, что активированный протеин С проявляет противовоспалительную активность в модели спонтанной и вызванной активации перитонеальных тучных клеток крысы. АРС дозозависимо в диапазоне низких концентраций блокирует спонтанную, вызванную веществом 48/80 и агонистами PAR1 секрецию -гексозаминидазы тучными клетками.

3. Установлено, что действие АРС на тучные клетки реализуется через PAR1, поскольку десенситизация PAR1 рецепторов тромбином отменяла вызванное низкими концентрациями АРС (<2.5 нМ) снижение секреции гексозаминидазы, инактивированный PMSF APC не имитировал действие фермента на тучные клетки, и АРС модулировал дегрануляцию тучных клеток, вызванную тромбином и PAR1-AP.

4. Предобработка тучных клеток катепсином G или дуоденазой, которая, как показано, активирует тучные клетки через рецепторы PAR1, отменяет защитный противовоспалительный эффект низких концентраций АРС на тучные клетки.

5. Противовоспалительное действие низких концентраций АРС на перитонеальные тучные клетки, обусловлено усилением генерации NО, о чем свидетельствует отмена защитного действия АРС в присутствии L-NAME.

6. На модели экспериментальной ацетатной язвы желудка у крыс показано, что АРС при однократном введении ускоряет заживление язвы, сокращая фазу воспаления и сдвигая на более ранние сроки фазу пролиферации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Макарова А.М., Киселева Е.В., Умарова Б.А., Струкова С.М. Участие рецептора активируемого протеиназой (PAR1) в регуляторных функциях тромбина при воспалении. // Научные труды I Съезда физиологов СНГ, под редакцией Р.И. Сепиашвили. М.: Медициназдоровье. 2005., Т.1., с. 13-14.

2. Макарова А.М., Киселева Е.В., Умарова Б.А., Струкова С.М. Тромбин регулирует активность клеток, участвующих в воспалении через PAR рецепторы. // Материалы Всероссийской конференции «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Современные достижения». Москва. 2005., с. 65-66.

3. Русанова А.В., Макарова А.М., Марквичева Е.А., Грандфис К., Струкова С.М.

Пептид – агонист рецептора тромбина как новый антиульцерогенный фактор. // Материалы международной конференции «Биотехнология и медицина». Москва. 2006., с. 217.

4. Русанова А.В., Макарова А.М., Струкова С.М., Марквичева Е.А., Горбачева Л.Р., Сташевская К.C., Васильева Т.В., Сидорова E.И., Беспалова Ж.Д., Грандфис К. Пептид - агонист рецептора тромбина, иммобилизованный в микросферы, ускоряет репаративные процессы в модели язвы желудка у крыс. // Бюлл. эксп. биол. мед. 2006. Т.142. № 7. с. 42-46.

5. Макарова А.М., Русанова А.В., Горбачева Л.Р., Умарова Б.А., Струкова С.М.

Влияние активированного протеина С на секреторную активность перитонеальных тучных клеток крысы. // Бюлл. эксп. биол. мед., 2006. Т.142. № 10. с. 382-385.

6. Макарова А.М., Русанова А.В., Замолодчикова Т.С., Румш Л.Д., Струкова С.М.

Агонисты PAR-рецепторов – модуляторы процессов воспаления и репарации тканей. // Материалы XIII Международной конференции и дискуссионного научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Украина, Гурзуф. 2006. с. 232-234.

7. Makarova A., Zamolodchikova T.S., Rumsh L.D., Smirnov M., Strukova S. APC and duodenase can control an inflammation via the PARs on mast cells. // 18th International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis Proteolysis. USA, San-Diego. 2006. р. 178-179.

8. Markvicheva Е., Stashevskaya K., Strukova S., Prudchenko I., Rusanova A., Makarova A., Vasilieva T., Bespalova J., Grandfils Ch. Biodegradable microparticles loaded with thrombin receptor agonist peptide for gastric ulcer treatment in rats. // J. Drug Del. Sci. Tech., 2006. V.16 (4).

P. 321-325.

9. Сташевская К.С., Марквичева Е.А., Струкова С.М., Русанова А.В., Макарова А.М., Горбачева Л.Р., Прудченко И.А., Зубов В.П., Грандфис К. Биодеградируемые микрочастицы с иммобилизованным пептидом для заживления ран. // Биомедицинская химия, 2006. Т.(1). с. 83-94.

10. Макарова А.М., Горбачева Л.Р., Русанова А.В., Струкова С.М. Роль рецептора PAR1 в протекторном противовоспалительном действии активированного протеина С // Материалы III Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием). Москва. 2007. с. 132-133.

11. Струкова С.М., Горбачева Л.Р., Сторожевых Т.П., Макарова А.М., Ишивата С.

Нейропротекторные и противовоспалительные свойства агонистов рецепторов, активируемых протеиназами. // Материалы III Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием). Москва. 2007. с. 231.

12. Макарова А.М., Замолодчикова Т.С., Румш Л.Д., Струкова С.М. Дуоденаза активирует перитонеальные тучные клетки крысы через рецепторы 1-типа, активируемые протеиназами. // Биоорг. Хим., 2007. №4. (в печати).

13. Макарова А.М., Горбачева Л.Р., Замолодчикова Т.С., Румш Л.Д., Смирнов М., Струкова С.М. Роль рецептора PAR1 в протекторном действии активированного протеина С при неиммунной активации тучных клеток. // Биомедицинская Химия. 2007 (в печати).

14. Макарова А.М., Замолодчикова Т.С., Румш Л.Д., Струкова С.М. Новые противовоспалительные функции активированного протеина С. // Материалы XX Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва. 2007 (в печати).

15. Макарова А.М., Горбачева Л.Р., Замолодчикова Т.С., Румш Л.Д., Струкова С.М.

Разнонаправленное действие сериновых протеиназ - активированного протеина С и дуоденазы на тучные клетки. // Материалы VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов». Москва. 2007 (в печати).

Pages:     | 1 | 2 ||



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.