WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Исследование активности тучных клеток, полученных от крыс с острым перитонитом. Для стабилизации клеток использовали антагонист Нгистаминовых рецепторов – кетотифен, который вводили животным интрагастрально (Dugina et al., 2003) за 10 часов и за 1 час до введения тиогликолата. Животным контрольной группы вводили кетотифен по той же схеме. Затем внутрибрюшинным введением тиогликолата Na вызывали острое воспаление у крыс и через 16 часов после его индукции выделяли перитонеальные тучные клетки и исследовали их активацию агонистами.

Определение агрегации тромбоцитов. Для анализа агрегации тромбоцитов использовали богатую тромбоцитами плазму (PRP) человека. Из цитратной крови получали PRP и бедную тромбоцитами плазму (PPP).

Агрегацию тромбоцитов определяли с помощью лазерного агрегометра (Биола, Россия).

Действие АРС на заживление экспериментальной язвы желудка. На модели повреждения слизистой оболочки желудка у крыс ледяной уксусной кислотой по методу Okabe (1971) в нашей модификации изучали действие АРС (Chromogenix). АРС (110 мкг/200г веса) вводили интрагастрально в плюроническом геле спустя 2 часа после операции. Динамику заживления язвы желудка оценивали на 3 и 7-е сутки после операции. Критериями оценки были относительная площадь язвы и параметры морфометрического анализа образцов грануляционной ткани.

Статистическую обработку данных проводили, используя t-критерий Стьюдента. Результаты представлены как средние значения из 4-6 независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего. Различия считали достоверными при значении Р<0.05. n - количество животных в эксперименте.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Динамика появления протеиназ гемостаза в перитонеальной полости крыс при воспалении Ранее в нашей лаборатории было показано увеличение проницаемости эндотелия сосудов тонкого кишечника и появление тромбина в перитонеальной полости крыс в первые 30-й мин острого воспаления (Киселева и др., 2004).

Мы предположили, что другие протеиназы гемостаза - фактор Ха, предшествующий тромбину и АРС, образуемый при активации тромбином (связанным с тромбомодулином эндотелия сосудов) профермента - протеина С – могут проникать в очаг острого воспаления из кровотока. Определение активности ферментов перитонеальной жидкости по отношению к амидазному субстрату Boc-Pro-Gly-Arg-pNA, специфичному к фактору Ха, не выявило появления фактора Ха в исследуемые промежутки времени (5-180 мин после индукции воспаления). Вместе с тем, подтверждено появление тромбина (специфически расщепляющего H-D-Phe-Pip-Arg-pNa) в очаге воспаления. При этом максимум концентрации тромбина (2.37±0.88 нМ/мг белка, n=6) наблюдали уже на 10-й минуте после индукции перитонита. Концентрация тромбина в перитонеальной жидкости оставалась достоверно высокой на протяжении первых 30 минут воспаления, а затем снижалась.

Рис. 1. Динамика появления АРС в перитонеальной жидкости крыс при развитии острого воспаления в течение 17 часов (n=6), *Р<0.05 – по отношению к 1-й мин воспаления.

Появление АРС в перитонеальной полости нами было обнаружено на 60-й минуте после индукции воспаления - в концентрации, в 3.6 раза превышающей исходную концентрацию (1 мин). Максимальную концентрацию АРС регистрировали на 120-й минуте развития воспаления (4.91±0.9 нМ/мг белка, n=6) (рис.1). Отсроченное появление АРС в перитонеальной полости можно объяснить малой эффективностью протеолиза профермента протеина С тромбином, что обусловлено блокадой экспрессии рецептора тромбина – тромбомодулина, при остром воспалении (Esmon, 2003).

У животных контрольной группы не наблюдали генерации фактора Ха, тромбина и АРС в исследуемые временные точки.

Доказательства в пользу появления тромбина в перитонеальной жидкости при воспалении были получены в следующей серии экспериментов с помощью высокоселективного специфического ингибитора тромбина – гирудина.

Показано, что в присутствии гирудина в перитонеальной жидкости крыс на 1030 мин после индукции воспаления не регистрируется амидазная активность по отношению к специфическому субстрату тромбина. Вместе с тем, присутствие гирудина не влияло на амидазную активность перитонеальной жидкости по отношению к специфическому субстрату АРС.

Так как нами было обнаружено появление АРС и тромбина в перитонеальной жидкости крыс при воспалении, в следующей серии экспериментов мы исследовали действие АРС и других протеиназ на перитонеальные тучные клетки в норме (спонтанная активность) и при их активации индукторами дегрануляции.

2. Влияние АРС на секреторную активность перитонеальных тучных клеток (в моделях спонтанной и вызванной активации) При исследовании влияния АРС на спонтанно активированные тучные клетки крысы нами было выявлено протекторное действие фермента на клетки.

Установлено, что в группе клеток с низкой спонтанной активностью (13.0±3.1%) АРС в концентрациях 0.5 и 1.0 нМ вызывал достоверное снижение секреции -гексозаминидазы на 54% и 28.4% (соответственно) относительно спонтанного уровня секреции (Р<0.05, n=7).

В группе тучных клеток с высокой спонтанной активностью (23.2±8.0%) обнаружено усиление протекторного эффекта АРС в низких концентрациях (0.5, 1.0 и 2.5 нМ, ЕС50=0.19 нМ) на клетки: достоверное снижение секреции гексозаминидазы соответственно на 43.8%, 36.7% и 25.1% относительно спонтанного уровня секреции (Р<0.05, n=6). При концентрациях АРС ниже 0.нМ (0.05 и 0.1 нМ) и выше 2.5 нМ (5.0-20 нМ) не наблюдали достоверного изменения секреции -гексозаминидазы (Рис. 2).

Рис. 2. Изменение секреции -гексозаминидазы перитонеальными тучными клетками крысы (с разной спонтанной секрецией) под действием АРС (*Р<0.05, **Р<0.01 по отношению к спонтанной секреции (СП), n=6).

Во второй серии экспериментов исследовано влияние АРС на секрецию медиатора тучными клетками, активированными стимулятором экзоцитоза - веществом 48/80, которое непосредственно активирует G-белок и индуцирует сигнальные пути, приводящие к дегрануляции тучных клеток (Metcalfe et al., 1997). В наших экспериментах вещество 48/80 в концентрации 400 мкг/мл вызвало высокую степень дегрануляции тучных клеток, а уровень секреции гексозаминидазы такими клетками составил 53.6±5.7%. Предварительная инкубация тучных клеток с АРС в диапазоне концентраций 0.5-2.5 нМ достоверно снижала вызванную веществом 48/80 секрецию -гексозаминидазы до 47.6±0.8 - 38.3±1.7% (Р<0.01, n=6) (Рис.3). Более высокие концентрации АРС (3 нМ) не вызывали достоверных изменений индуцированной веществом 48/80 секреции.

Рис. 3. Влияние АРС на вызванную веществом 48/80 секрецию -гексозаминидазы перитонеальными тучными клетками (*Р<0.05, **Р<0.01 по отношению к секреции, вызванной веществом 48/80, n=6).

В третьей серии экспериментов мы исследовали действие АРС на тучные клетки, полученные от животных с острым перитонитом, который вызывали внутрибрюшинным введением тиогликолата Na. Для стабилизации клеток использовали антагонист Н1 гистаминовых рецепторов – кетотифен. Секреция -гексозаминидазы тучными клетками под действием вещества 48/80 была принята за 100%. Было показано, что в опытной группе (тучные клетки, полученные от животных с перитонитом) АРС в концентрациях 0.01, 0.05, 0.1 и 1.0 нМ снижал секрецию -гексозаминидазы на 30.96±8.9, 38.52±9.8, 37.93±1.и 38.6±13.35% (относительно действия вещества 48/80) (Р<0.05, n=5) (Рис.4). В контрольной группе АРС в тех же концентрациях не вызвал изменений в секреции -гексозаминидазы тучными клетками. Эти данные свидетельствуют в пользу нашей гипотезы о том, что АРС в низких концентрациях регулирует активность тучных клеток не только в норме, но и при воспалении (остром перитоните у крыс), блокируя секрецию медиаторов воспаления тучными клетками.

Рис. 4. Действие АРС на тучные клетки, полученные от животных с острым перитонитом (вызванная веществом 48/80 секреция -гексозаминидазы принята за 100%, *Р<0.05, **Р<0.01 по отношению к секреции, вызванной веществом 48/80, n=5).

Так как активация свертывания крови при воспалении ведет к образованию ряда протеиназ системы гемостаза, предшествующих появлению АРС, в следующих экспериментах нами было проведено сравнение эффекта АРС с действием других протеиназ (фактора Ха и тромбина) на тучные клетки.

Показано, что фактор Ха в диапазоне концентраций 0.2-45 нМ вызывал повышение секреции -гексозаминидазы тучными клетками. Максимум секреции медиатора составил 40.3±8.3% при спонтанной секреции 18.7±7.3% (Р<0.05, n=8). При этом предварительная (в течение 10 минут) инкубация тучных клеток с фактором Ха не влияла на секрецию, вызванную веществом 48/80. Сравнение эффекта фактора Ха с действием тромбина на тучные клетки показало, что фактор Ха - более сильный индуктор дегрануляции, поскольку его максимальное провоспалительное действие проявляется в значительно меньших (на 2 порядка) концентрациях (ЕС50 = 0.64нМ), чем действие тромбина (ЕС50 = 87нМ). Таким образом, фактор Ха, образуемый на стадии инициации свертывания крови в низких (нМ) концентрациях, еще до появления тромбина может проявлять провоспалительную активность, стимулируя секрецию тучных клеток.

Известно, что тучные клетки тонкого кишечника секретируют, наряду с катепсином G - антагонистом/агонистом PAR1, триптазой - агонистом PAR2, сериновую протеиназу - дуоденазу, первоначально обнаруженную в бруннеровых железах двенадцатиперстной кишки (Zamolodchikova et al., 2000;

Pemberton et al., 2002). О роли дуоденазы в воспалительных реакциях организма и регуляции активности тучных клеток перитонеальной полости нет данных.

Мы предположили, что дуоденаза, помимо участия в каскаде активации ферментов пищеварения, может регулировать секреторную функцию тучных клеток через активацию рецепторов PAR1. Обнаружено, что дуоденаза в концентрациях 1.0, 8.0 и 80 нМ вызывает повышение секреции гексозаминидазы на 30, 69 и 159% относительно уровня спонтанной секреции (Р<0.05, n=5). Положительная дозозависимая корреляция секреции гексозаминидазы от концентрации дуоденазы может указывать на ее провоспалительную активность. Однако, предварительная инкубация клеток с дуоденазой (0.1-80 нМ) не влияла на секрецию, вызываемую веществом 48/80.

Итак, наши данные свидетельствуют о том, что протеиназы гемостаза - АРС, тромбин и фактор Ха и протеиназа тучных клеток – дуоденаза, участвуют в регуляции начальных стадий воспаления, вызывая повышение (тромбин, фактор Ха, дуоденаза) или снижение (АРС) секреции медиатора воспаления - гексозаминидазы тучными клетками. Обнаружено появление АРС и тромбина в перитонеальной полости крыс при воспалении и выявлен защитный противовоспалительный эффект низких концентраций АРС (0.01-10 нМ) на тучные клетки, полученные от животных с перитонитом.

3. Механизмы действия АРС на тучные клетки Участие рецепторов PAR в действии АРС на тучные клетки Об участии рецепторов PAR в реализации действия протеиназы на функцию клетки может свидетельствовать изменение ответа клетки при действии инактивированной протеиназы, не способной расщеплять рецептор, а также изменение ответа клетки на АРС после десенситизации PAR.

Для проверки предположения о действии АРС на тучные клетки через PAR получали инактивированный с помощью PMSF фермент. Инактивация АРС приводила к потере более 98% амидазной активности по отношению к специфическому хромогенному субстрату (pyroGlu-Pro-Arg-pNA). Обнаружено, что инактивированный АРС теряет способность регулировать активность тучных клеток и секреция -гексозаминидазы в ответ на инактивированный АРС (1нМ) составила 22.9±4.9% при спонтанной секреции - 22.8±3.7% (Рис. А). В то же время активная форма АРС (1нМ) вызывала достоверное снижение секреции тучных клеток - до 14.7±3.6% (P<0.05, n=6). Эти данные свидетельствует о действии АРС на тучные клетки через протеолитически расщепляемый рецептор (PAR), хотя не опровергают возможного вклада нерасщепляемого рецептора EPCR в реализацию действия АРС.

Рис. 5. Отмена эффекта АРС (черные столбцы) на тучные клетки после инактивации фермента (полосатый столбец) (А) или десенситизации PAR1 тромбином (100нМ, 10мин, полосатые столбцы) (Б), *Р<0.05 по отношению к спонтанной секреции (СП), n=4.

В следующей серии опытов для выяснения подтипа PAR рецепторов, опосредующих действие АРС на тучные клетки, проводили десенситизацию PAR1 тромбином. Показано, что десенситизация PAR1 отменяла ответ клеток на последующие предъявления АРС (Рис. 5 Б), при этом сохранялся ответ клеток на вещество 48/80, вызывающее дегрануляцию клеток без участия специфических рецепторов. Так, если АРС в концентрациях 0.7-1.5 нМ вызывал достоверное снижение секреции -гексозаминидазы тучными клетками относительно спонтанного уровня, то после десенситизации PAR1 рецепторов тромбином этот эффект при последующих предъявлениях АРС отсутствовал (Р<0.05, n=4).

Об участии рецепторов PAR1 в реализации действия АРС на тучные клетки также свидетельствуют эксперименты, в которых предварительная инкубация клеток с АРС (1.2 нМ) отменяла провоспалительный эффект пептида-агониста PAR1 (50 мкМ) (Рис. 6). Эти данные подтверждают гипотезу о регуляторном действии АРС на тучные клетки через активацию PAR1.

Рис. 6. Предварительная активация тучных клеток АРС (1.2 нМ) отменяла провоспалительное действие PAR1-AP (50 мкМ) на клетки (*Р<0.05 - по отношению к спонтанной секреции (СП), n=4).

Выяснение типа рецептора фактора Ха на тучных клетках показало, что десенситизация PAR1 тромбином (100нМ) не влияла на секрецию медиатора, вызванную фактором Ха (45 нМ), что свидетельствует о его действии на тучные клетки не через PAR1. Предварительная обработка тучных клеток АРС (0.9 нМ) так же не влияла на вызванную фактором Ха (2.4 нМ) секрецию гексозаминидазы. Возможно, рецептором фактора Ха на тучных клетках (как и на других клетках (Strukova 2006)) является PAR2.

Рис. 7. Отмена действия дуоденазы (полосатые столбцы) на тучные клетки после десенситизации PAR1 тромбином (100нМ, 10мин, черные столбцы), n=4.

Рис. 8. Предварительная инкубация тучных клеток с катепсином G (4мкМ) или дуоденазой (8 нМ) отменяла защитный противовоспалительный эффект АРС (0.5 нМ, черные столбцы) на тучные клетки. * Р<0.05 - по отношению к спонтанной секреции (СП), n=5.

Рецептором на тучных клетках для дуоденазы, по-видимому, является PAR1, т.к. блокада ферментативной активности дуоденазы с помощью SBBI (соевый ингибитор протеиназ Баумана-Бирка) привела к существенному ингибированию (на 40%) способности дуоденазы активировать тучные клетки, а десенситизация PAR1 рецепторов тромбином отменяла действие дуоденазы (20 нМ) на клетки (Р<0.05, n=4) (Рис. 7).

Pages:     | 1 || 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.