WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

МАКАРОВА АНАСТАСИЯ МИХАЙЛОВНА ПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ АКТИВИРОВАННОГО ПРОТЕИНА С ПРИ ВОСПАЛЕНИИ И РЕПАРАЦИИ ТКАНЕЙ 03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2007 1

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, заведующий – доктор биологических наук, профессор А.А. Каменский НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор С.М. Струкова ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Е.Г. Колокольчикова, кандидат биологических наук А.Е. Коган ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт Физиологически Активных Веществ РАН

Защита диссертации состоится 21 мая 2007г. в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д501.001.93 при Биологическом факультете Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 20 апреля 2007г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Б.А. Умарова 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

При повреждении тканей активируются процессы свертывания крови и воспаления, образуется ряд протеиназ, в том числе сериновые протеиназы системы гемостаза - тромбин, фактор Ха (фХа) и активированный протеин С (АРС). Тромбин - ключевой прокоагулянт, поскольку превращает фибриноген в фибрин - основу тромба, активирует факторы V, VIII, XI, XIII свертывания крови. Связывая рецепторы, активируемые протеиназами (PAR1 и PAR4), тромбин индуцирует агрегацию тромбоцитов, активацию клеток крови, соединительной ткани и запускает процессы воспаления (Coughlin 2000, 2005;

Струкова 2001, 2006). Вместе с тем, тромбин регулирует свертывание крови по механизму отрицательной обратной связи, поскольку связывает на эндотелии нерасщепляемый рецептор – тромбомодулин и превращает протеин С в антикоагулянт - активированный протеин С. АРС, в свою очередь инактивирует факторы Va и VIIIa, участвующие в образовании протромбина, и тем самым блокирует процесс тромбообразования (Esmon 2003, 2005).

В последнее время активно развивается представление о противовоспалительном и антиапоптотическом действии АРС на эндотелиальные клетки и моноциты, а также о его протекторном действии при системном воспалении и сепсисе (Joyce еt аl., 2004; Mosnier, Griffin 2006).

Показано взаимодействие АРС с двумя мембранными рецепторами - эндотелиальным рецептором протеина С (ЕРСR) (Esmon 2000) и РАRэндотелия (Reiwald, Ruf 2005; Feistritzer et al., 2006). Рецепторы PARэкспрессируются всеми клетками, вовлекаемыми в процессы свертывания крови, воспаления и репарации тканей, что позволяет предполагать их участие в осуществлении острых защитных реакций организма и в патогенезе хронических процессов (Macfarlane еt аl., 2001; Струкова 2001, 2006). В связи с этим весьма актуальным является изучение рецептор-опосредованных механизмов противовоспалительного действия АРС.

Известно, что при воспалении активируются тучные клетки и освобождают широкий спектр провоспалительных медиаторов, в том числе гистамин, -гексозаминадазу, протеазы, цитокины, оксид азота (NO) и др.

(Metcalfe еt аl., 1997). NO регулирует активность тучных клеток, повышая уровень цГМФ, секрецию медиаторов и ингибируя агрегацию тромбоцитов (Bunnett 2006). Тучные клетки тонкого кишечника секретируют дуоденазу (ЕС 3.4.21) – сериновую протеиназу, обнаруженную в слизистой двенадцатиперстной кишки, которая помимо участия в активации протеиназ пищеварения, может играть роль в воспалении (Pemberton et al., 2002).

Роль АРС и других сериновых протеиназ в механизмах, ответственных за запуск, развитие и/или регуляцию воспалительных и репаративных процессов в тканях еще не достаточно исследована, хотя известно, что повышается экспрессия PAR на поверхности клеток, участвующих в основных этапах репарации тканей (воспалении, пролиферации клеток и созревании ткани) (Струкова 2001). Ранее в нашей лаборатории было установлено PAR1опосредованное действие тромбина и пептидов - агонистов PAR1 (PAR1-AP) на тучные клетки и выявлена аутокринная регуляция оксидом азота ответа тучных клеток (Strukova еt аl., 1996, 1999). На модели острого перитонита у крыс было показано усиление секреции медиаторов тучными клетками в ответ на действие тромбина и PAR1-АР, что свидетельствует о дополнительной экспозиции PARна тучных клетках в условиях воспаления (Dugina еt аl., 2003).

Иммобилизованный в полимерные матрицы PAR1-АР ускоряет заживление кожных ран (у мышей и крыс), что подтверждает регуляторную функцию агонистов PAR1 при воспалении - первой фазе заживления ран (Strukova et al., 2001, 2002; Дугина и др., 2004). Однако до настоящего времени не было исследовано влияние АРС на активность тучных клеток при воспалении. В связи с этим изучение участия тучных клеток в реализации противовоспалительного действия АРС, а также влияние АРС на процесс заживления экспериментальной язвы желудка представляется весьма актуальным и перспективным.



Цели и задачи исследования.

Цель работы – выявление механизмов действия активированного протеина С (АРС) на секреторную активность тучных клеток при воспалении, и выяснение участия АРС в репарации тканей на модели экспериментальной язвы желудка.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику появления протеиназ системы гемостаза (фXа, тромбина, АРС) в перитонеальной жидкости (на модели острого воспаления у крыс).

2. Изучить влияние АРС на секреторную активность перитонеальных тучных клеток в моделях спонтанной и вызванной активации. Оценить влияние АРС на активность тучных клеток, полученных от крыс с острым перитонитом.

3. Исследовать PAR- опосредованные механизмы действия АРС на тучные клетки.

4. Исследовать действие АРС на процесс заживления экспериментальной язвы желудка.

Научная новизна работы. На модели острого воспаления у крыс впервые обнаружено появление сериновой протеиназы системы гемостаза – АРС, вслед за появлением тромбина в перитонеальной жидкости.

Впервые показано, что противовоспалительное действие АРС может реализовываться через регуляцию активности тучных клеток. В моделях спонтанной и вызванной активации перитонеальных тучных клеток выявлено, что АРС дозозависимо в узком диапазоне низких концентраций блокирует секрецию медиаторов воспаления тучными клетками. Кроме того, впервые показано протекторное влияние АРС на секреторную активность тучных клеток, полученных от крыс с острым воспалением.

Впервые установлено, что действие АРС на тучные клетки реализуется через активацию PAR1 рецепторов, поскольку их десенситизация тромбином предотвращает вызываемое АРС снижение секреции -гексозаминидазы, а инактивированный APC не имитирует действие фермента на тучные клетки.

Показано, что действие АРС на тучные клетки блокируется катепсином G и протеиназой желудочно-кишечного тракта и тучных клеток – дуоденазой, которая, как установлено, стимулирует секрецию медиаторов воспаления перитонеальными тучными клетками через PAR1. Показано, что регуляция секреторной активности тучных клеток АРС обусловлена усилением генерации эндогенного оксида азота, о чем свидетельствует отмена защитного действия АРС в присутствии L-NAME - ингибитора образования NO.

На модели экспериментальной язвы желудка у крыс впервые показано, что АРС при однократном введении сокращает фазу воспаления и сдвигает фазу пролиферации на более ранние сроки, что приводит к ускорению заживления язвы желудка.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты данного исследования имеют важное как теоретическое, так и практическое значение. Полученные данные расширяют представления о механизмах защитных функций активированного протеина С в процессах воспаления. Нами обнаружено появление протеиназ системы гемостаза (тромбина и АРС) в перитонеальной жидкости на модели острого воспаления у крыс. Впервые выявлено противовоспалительное действие АРС на перитонеальные тучные клетки в норме и при воспалении. Показано, что АРС блокирует секрецию медиаторов воспаления тучными клетками через высокоспецифичную активацию PAR1 рецептора и аутокринную регуляцию оксидом азота ответа тучных клеток.

Имеют практическое значение данные о том, что АРС, подобно пептидуагонисту PAR1, иммобилизованному в полимерные микрочастицы, способен ускорять (после однократного внутрижелудочного введения) заживление экспериментальной язвы желудка. Создание нового класса антиульцерогенных препаратов на основе АРС и пептидов-агонистов PAR1 представляется перспективным в связи с их высокой эффективностью.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты работы были доложены на I Съезде физиологов СНГ (Россия, Дагомыс, 2005), Всероссийской конференции «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром.

Современные достижения» (Россия, Москва, 2005), Международной конференции «Биотехнология и медицина» (Россия, Москва, 2006), XIII Международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, Гурзуф, 2006), 18-м Международном конгрессе по фибринолизу и протеолизу (USA, San-Diego, 2006), заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (Россия, Москва, 2006), III Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Россия, Москва, 2007), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Россия, Москва, 2007).





Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ (в том числе 6 статей).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах и включает введение, обзор литературы, описание объекта и методов исследования, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы (содержит 246 источников). Работа иллюстрирована рисунками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Все эксперименты с животными выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и декларацией о гуманном отношении к животным. В работе использовали самцов крыс Вистар весом 250-300г.

Материалы: АРС (Chromogenix, Sigma); синтетический пептид – агонист PAR1 (PAR1-АР, SFLLRN) (Biosyntan, Berlin, Germany; Российский Кардиологический Научно-производственный комплекс МЗ РФ, Москва, Россия); дуоденаза (26.5кДа, любезно предоставлена к.х.н. Т.С.

Замолодчиковой, ИБХ РАН, Москва); фактор Xa, -тромбин человека, фиколл400, L-NAME, фенилметилсульфонил фторид (PMSF), хромогенный субстрат для -гексозаминидазы - р-нитрофенил-N-ацетил--D-глюкозаминид (Sigma);

хромогенные субстраты для АРС - pyroGlu-Pro-Arg-pNA (S-2366), для тромбина - H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S2238), для фХа - Boc-Pro-Gly-Arg-pNA (S2222) (Chromogenix); для дуоденазы - Tos-Gly-Pro-Lys-pNA (Sigma); АДФ, фактор активации тромбоцитов (PAF) (Serva); вещество 48/80 (Biomol); Трис (ICN).

Раствор Тироде (все реактивы Sigma): NaCl 145мМ, HEPES 10мМ, KCl 5мМ, CaCl2 1мМ, MgCl2 1мМ, глюкоза 5мМ, 0.1% сывороточного альбумина, рН 7.4; буфер Na-HEPES: NaCl 145мМ, HEPES 10мМ, рН 7.4.

В работе использовали следующие методы:

Определение содержания АРС, тромбина и фХа в перитонеальной жидкости крыс при воспалении. Острое воспаление у крыс вызывали внутрибрюшинным введением 40%-го раствора тиогликолата Na в дозе 4г/кг (по методу Pejler, 1999) в модификации Dugina et al., 2003). В исследуемые интервалы времени (1-30 мин, 1-17 часов после инициации перитонита) отбирали образцы экссудата из перитонеальной полости, клетки отделяли центрифугированием и в супернатанте определяли содержание общего белка (по методу Бредфорд) и амидазную активность ферментов по отношению к специфическим хромогенным субстратам: тромбина - S2238 (H-D-Phe-Pip-ArgpNa), АРС - S2366 (pyroGlu-Pro-Arg-pNA) или фХа - S2222 (Boc-Pro-Gly-ArgpNA). Стандартные препараты тромбина (1000 NIH ед/мг), АРС и фХа использовали для построения калибровочных графиков. Количество протеиназ рассчитывали на общее количество белка в пробе.

Для характеристики воспаления рассчитывали индекс дегрануляции (ИД) тучных клеток по формуле: ИД=Д/(Д+Н), где Д – количество дегранулированных тучных клеток, Н – количество не активированных тучных клеток.

Концентрирование и определение активности АРС. АРС (Chromogenix, CША) освобождали от примеси солей и пептидов (< 10кДа) и концентрировали в пробирках Центрикон-10 пятикратным центрифугированием и отмывкой. Определяли амидазную активность APC по отношению к хромогенному субстрату S2366 (pyroGlu-Pro-Arg-pNA) и антикоагулянтную активность АРС по удлинению активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) свертывания плазмы крови человека.

Количество АРС рассчитывали по калибровочному графику, построенному с использованием стандарта (АРС, Sigma).

Активность дуоденазы определяли спектрофотометрически по отношению к субстрату Tos-Gly-Pro-Lys-pNA.

Влияние протеиназ и пептидов-агонистов PAR1 на секрецию перитонеальных тучных клеток. Тучные клетки выделяли из перитонеальной полости самцов крыс линии Вистар по методу Thon, Uvnas (1967) в нашей модификации. Перитонеальные тучные клетки инкубировали (10 мин при 37°С) с препаратами: АРС; АРС, инактивированного PMSF; дуоденазы;

дуоденазы, инактивированной SBВI; тромбина; фактора Ха; PAR1-AP. Для ингибирования синтеза NO, тучные клетки инкубировали с 300 мкМ L-NAME (30 мин при 37°С). Исследовали действие АРС (0.5-20нМ) на клетки, активированные веществом 48/80 (400мкг/мл). Отбирали аликвоты для определения активности -гексозаминидазы методом Schwartz et al. (1982) по расщеплению хромогенного субстрата - р-нитрофенил-N-ацетил--Dглюкозаминида. Вычисляли содержание -гексозаминидазы по формуле:

%секреции=А/(А+Б)·100%, где А – содержание -гексозаминидазы в супернатанте, Б – в осадке.

Десенситизировали PAR1 рецепторы 100нМ тромбином до добавления действующих концентраций агонистов (АРС, фХа, дуоденазы). Принцип метода основан на способности активированных рецепторов к интернализации и толерантности к последующим предъявлениям агониста.

Pages:     || 2 | 3 |





© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.