WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

У двух образцов ДНК, выделенных из штаммов M. smegmatis, получены фрагменты спейсера 16S-23S рДНК размером 450 п.н. При рестрикции ПЦРпродуктов исследованных штаммов ферментом HaeIII генерируются фрагменты 200/110 п.н. (Табл. 1, Рис. 2). Полученные данные позволяют дифференцировать M.

smegmatis от M. fortuitum Y и M. fortuitum Z.

М – маркер; 1 - M. smegmatis (200/п.н.); 2 - M. fortuitum (220/140/100 п.н.);

3 - M. fortuitum (220/140/100 п.н.); 4 - M.

fortuitum (240/220 п.н.).

п.н.

М 1 2 3 Рис. 3. Электрофореграмма рестрикции амплифицированного фрагмента спейсера 16S-23S рДНК (450 п.н.) микобактерий рестриктазой HaeIII.

При амплификации ДНК, выделенной из штамма M. chelonae/M. abscessus, получен фрагмент спейсера размером 450 п.н. При рестрикции ПЦР-продукта ферментом HaeIII образуются фрагменты 215/125/105 п.н. Полученные данные позволяют дифференцировать M. chelonae/M. abscessus, M. smegmatis, M. fortuitum Y и M. fortuitum Z.

В результате амплификации ДНК, выделенной из двадцати штаммов M.

tuberculosis complex получены ПЦР-продукты размером 370 п.н. Фрагменты рестрикции, продуцируемые HaeIII, имеют длину 215/95/55 п.н. Профиль рестрикции M. tuberculosis complex отличается от профилей рестрикции НТМБ, но не имеет различий между видами внутри комплекса (Табл. 1).

При рестрикции ПЦР-продуктов спейсера 16S-23S рДНК 31 штамма M. avium ферментом HaeIII генерируются фрагменты ДНК 130/115/80/40 п.н. (Табл. 1, Рис. 4.).

При амплификации спейсера 16S-23S рДНК штаммов M. kansasii получены ПЦР-продукты 370 п.н. Известно два вида паттернов, присущих этому виду.

Амплификат одного из них рестрицируется HaeIII на фрагменты 170/130/65 п.н. (M.

kansasii II), а амплификат другого не рестрицируется HaeIII (M. kansasii I) [Lappayawichit P. et al., 1996]. ПЦР-продукт спейсера 16S-23S рДНК (370 п.н.) анализируемых штаммов M. kansasii при обработке ферментом HaeIII не рестрицируется. Проведена дополнительная обработка ферментом BstXI и получены фрагменты размером 215/150 п.н. Эти результаты позволяют отнести штаммы к группе M. kansasii I (Табл. 1).

Таблица 1.

Результаты исследования коллекции микобактерий методом рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК.

№ Виды Размер ПЦР Размер Размер Размер Кол-во продукта рестрикционных рестрикционных рестрикционны штамм фрагментов фрагментов фрагментов ов (HaeIII) (BstXI) (MspI) 1. M. - - 370 пн 215/95/55 п.н.

tuberculosis 2. M. avium - - 370 пн 130/115/80/п.н.

3. M. - 370 пн 200/130/40 240/105/intracellulare п.н. п.н.

4. M. - - 370 пн 130/110/95/scrofulaceum п.н.

5. M. ulcerans - - 370 пн 215/155 п.н.

6. M. kansasii Не - 370 пн 215/150 п.н.

рестрицируется 7. M. gordonae Не - 370 пн 205/155 п.н.

рестрицируется 8. M. smegmatis - - 450 пн 200/110 п.н.

9. M. - - 450 пн 215/125/chelonae/M.

п.н.

abscessus 10. M. fortuitum I - - - 470/пн 11. M. fortuitum - - - 450/II пн 12. M. fortuitum - - - 470 пн X 13. M. fortuitum - - 450 пн 220/140/Y п.н.

14. M. fortuitum - - 450 пн 240/220 п.н.

Z М – маркер; 1 - M. tuberculosis complex;

2 - M. ulcerans; 3 - M. intracellulare; 4 - M. avium; 5 - M. scrofulaceum.

п.н.

М 1 2 3 4 5 М Рис. 4. Продукты рестрикции амплифицированного фрагмента спейсера 16S-23S рДНК (370 п.н.) микобактерий рестриктазой HaeIII.

Амплификат спейсера 16S-23S рДНК (370 п.н.) штаммов M. gordonae ферментом HaeIII не рестрицируются. При дополнительной обработке ПЦРпродуктов ферментом BstXI образуются фрагменты размером 205/155 п.н. (Табл. 1).

Штаммы M. scrofulaceum из нашей коллекции были отнесены к группе M.

scrofulaceum II, так как амплифицированные участки спейсера 16S-23S рДНК (п.н.) расщепляются рестриктазой HaeIII на фрагменты 130/110/95/40 п.н. (Табл. 1).

По опубликованным данным генетическая разнородность фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рДНК вида M. scrofulaceum выражается в различии профилей рестрикции. Описаны следующие паттерны полиморфных по длине фрагментов рестрикции ферментом HaeIII: M. scrofulaceum I - 200/130/40 п.н., M.

scrofulaceum II - 130/110/95/40 п.н., M. scrofulaceum III - 180/130/40 п.н., M.

scrofulaceum IV - 180/170 п.н. [Lappayawichit P. et al., 1996].

У штаммов, относящихся к виду M. intracellulare, при обработке рестриктазами HaeIII и MspI ПЦР-продукта (370 п.н.) образуются фрагменты ДНК длиной 200/130/40 п.н. и 240/105/25 п.н., соответственно (Табл. 1). Рестрикция ферментом MspI осуществляется для дифференциации M. intracellulare и M. scrofulaceum I, так как профиль рестрикции HaeIII для вышеперечисленных видов одинаков. У штамма M. ulcerans при амплификации участка спейсера 16S-23S рДНК образуется один фрагмент размером 370 п.н. При обработке продукта ПЦР рестриктазой HaeIII генерируются фрагменты 215/155 п.н.

Полученные данные показывают, что метод рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК позволяет определять видовую принадлежность нетуберкулезных микобактерий. Кроме этого метод позволил выявить внутривидовую вариабельность штаммов M. fortuitum. Достоинства метода заключаются в высокой специфичности, быстром получении результатов анализа и возможности обнаружения ДНК единичных микобактериальных клеток в клиническом материале. Метод является альтернативой более дорогому и требующему специального оборудования методу секвенирования.

Высокопроизводительная жидкостная хроматография миколовых кислот (high performance liquid chromatography – HPLC).

В работе были исследованы 37 штаммов из нашей коллекции НТМБ (M. avium – 15, M. intracellulare – 3, M. gordonae – 2, M. kansasii/M. gastri – 5, M. scrofulaceum – 2, M. fortuitum – 9, M. chelonаe/M. abscessus - 1). В качестве негативного контроля для HPLC использовали Candida albicans, микроорганизм, не продуцирующий миколовые кислоты вообще, в качестве позитивного - Mycobacterium avium. Образцы взяты из коллекции Центра контроля и предупреждения заболеваний (США).

В результате HPLC для 20 микобактериальных культур были получены сходные хроматографические паттерны, являющиеся характерными для группы MAIS, которая включает такие виды как M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum (рис. 5). Методы ПЦР – секвенирования фрагмента гена, кодирующего синтез 16S рРНК и рестрикционный анализ амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК позволили определить видовую принадлежность культур группы MAIS. Две из них принадлежали к виду M.

scrofulaceum, четырнадцать - идентифицированы как вид M. avium, четыре - M.

intracellulare.

Det 166 Det AV080405 05-AV080405.dat 05-645.dat Retenti on T ime Retention Time 0.200 0.0.05 Name 0.05 Name 0.175 0.0.04 0.0.150 0.0.125 0.0.03 0.0.100 0.0.075 0.0.02 0.0.050 0.0.01 0.01 0.025 0.0.000 0.0.00 0.-0.025 -0.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Minut es Minut es А Рис. 5. Хроматограммы миколовых кислот Б А – MAIS (M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum); Б – M. kansasii/M. gastri Для пяти микобактериальных культур получены хроматографические паттерны, являющиеся характерными M. kansasii/M. gastri (рис. 5). В результате сравнения полученных хроматографических паттернов с референсными, две микобактериальные культуры были идентифицированы как M. gordonae (рис. 6).

Результаты видовой идентификации совпадают с данными, полученными методами ПЦР – секвенирования фрагмента гена, кодирующего синтез 16S рРНК и рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной 5.8.417 B7.650 B8.133 B5B AU AU AU AU 5.617 A4.933 F8.583 B8.300 B7.533 B7.450 B7.950 B5A 4.267 F5.5.867 A4.567 F4.700 F7.333 B7.717 B7.250 B3.5.067 A5.900 A2.250 S2.517 S3.333 S6.200 M2.6.517 M7.000 M8.467 B9.417 REF 6.783 M3.6.167 M7.150 B9.667 REF 3.400 S6.467 M6.950 M6.717 M7.833 B8.050 B5B 8.250 Bпоследовательности 16S-23S рибосомной ДНК. В результате HPLC для девяти микобактериальных культур получены одинаковые хроматографические паттерны, являющиеся характерными для M. fortuitum/M. peregrinum (рис. 6).ПЦР – секвенирование и рестрикционный анализ обеспечивает дифференциацию внутри комплекса видов M. fortuitum/M. peregrinum. Все культуры идентифицированы как M.

fortuitum. Кроме этого, рестрикционный анализ позволил отнести исследованные культуры к различным геногруппам вида M. fortuitum. Для одной культуры получен хроматографический паттерн, соответствующий M. chelonae/M. abscessus (рис. 6). Ни один из использованных нами методов не позволил разделить эти два генетически близких вида.

0.10 Det 166 0.10 Det 05-681 05-05-681.dat 05-670.dat Retention Time 0.225 Retention Time 0.Name Name 0.09 0.0.200 0.0.08 0.А Б 0.175 0.0.07 0.0.150 0.0.06 0.0.125 0.0.05 0.0.100 0.0.04 0.0.075 0.0.03 0.0.050 0.0.02 0.0.025 0.0.01 0.0.000 0.0.00 0.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Minut es Minut es Det 05-05-664.dat Retention Time 1. 6 Name 1.В 1. 4 1.Рис. 6. Хроматограмма миколовых кислот 1. 2 1.А – M. gordonae 1. 0 1.Б – M. fortuitum/M. peregrinum 0. 8 0.В - M. chelonae/M. abscessus 0. 6 0.0. 4 0.0. 2 0.0. 0 0.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Minut es Таким образом, метод HPLC позволяет определить видовую принадлежность микобактерий. Однако его дифференциально-диагностическая способность несколько ниже, чем у методов ПЦР-секвенирования гена 16S рРНК и рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК в связи со сходным составом миколовых кислот у близкородственных видов.

7.117 M7.800 B7.533 B7.750 B7.933 B5A 6.317 MAU AU AU AU 8.117 B5B 6.533 M6.083 M7.333 B6.900 M3.7.033 M2.133 S2.117 S8.283 B3.383 S4.267 F5.800 A6.633 M8.433 B5.100 A2.917 S4.683 F2.633 S2.433 S8.583 B8.733 B8.883 C9.433 REF 5.283 A3.3.8.833 C8.983 C4.4.817 F5.467 A6.9.117 C9.417 REF 5.817 A6.150 M9.833 D7.317 B7.617 B8.500 BAU AU 8.317 B8.700 B6.917 M2.500 S8.050 B5B 7.450 B2.850 S3.383 S3.4.500 F4.983 F5.650 A6.100 M7.200 BЛекарственная устойчивость НТМБ.

Определение уровней устойчивости штаммов НТМБ к стрептомицину, изониазиду, рифампицину, канамицину и этамбутолу на среде Левенштейна-Йенсена проводили методом абсолютных концентраций (приказ № 109 от 21 марта 2003 г.).

Лекарственной устойчивостью ко всем проверенным препаратам в максимальных концентрациях обладали следующие виды нетуберкулезных микобактерий: M. chelonаe/M. abscessus, M. peregrinum и M. ulcerans.

Высокий уровень лекарственнной устойчивости отмечен для штаммов M.

fortuitum. Три штамма (23%) устойчивы ко всем пяти препаратам в максимальных концентрациях. Все штаммы этого вида устойчивы к концентрации 50 мкг/мл стрептомицина и к 50 мкг/мл рифампицина. Три штамма (23%) устойчивы к концентрации изониазида 25 мкг/мл, восемь штаммов (61,5%) - устойчивы к концентрации 5 мкг/мл и два штамма (15,5%) устойчивы только к критической концентрации этого препарата (1 мкг/мл). Одиннадцать штаммов (85%) устойчивы к концентрации 50 мкг/мл канамицина, один штамм (61,5%) - устойчив к концентрации 30 мкг/мл. Только один штамм чувствителен к канамицину. Четыре штамма (31%) устойчивы к концентрации этамбутола 5 мкг/мл, шесть – только к концентрации мкг/мл.

Семь штаммов M. avium (22%) устойчивы ко всем пяти препаратам в максимальных концентрациях. 25 штаммов M. avium (80,6%) устойчивы к концентрации стрептомицина 50 мкг/мл, шесть (19,4%) - устойчивы к концентрации 10 мкг/мл. Одиннадцать штаммов (35,5%) устойчивы к концентрации изониазида мкг/мл, 19 штаммов (61,3%) - устойчивы к концентрациям 5 мкг/мл и один штамм (3,2%) устойчив только к критической концентрации этого препарата (1 мкг/мл).

Устойчивы к канамицину (50 мкг/мл) – 27 штаммов (87%) и только четыре штамма M. avium (13%) чувствительны. Устойчивы к концентрации 5 мкг/мл этамбутола – штаммов (90,3%). К критической концентрации этого препарата устойчивы три штамма (9,7%). К критической концентрации рифампицина устойчивы четыре штамма M. avium (13%). Устойчивы к концентрации рифампицина 50 мкг/мл – штаммов (87%).

Два штамма M. intracellulare (17%) устойчивы ко всем пяти препаратам в максимальных концентрациях. Три штамма M. intracellulare (25%) устойчивы к концентрации стрептомицина 50 мкг/мл, девять (75%) - устойчивы к концентрации 10 мкг/мл. Шесть штаммов (50%) устойчивы к концентрации изониазида 25 мкг/мл и шесть штаммов (50%) - устойчивы к концентрации 5 мкг/мл. Устойчивы к канамицину (50 мкг/мл) – девять штаммов (75%) и только три штамма M.

intracellulare (25%) чувствительны. Устойчивы к концентрации 5 мкг/мл этамбутола– девять штаммов (75%). К критической концентрации этого препарата устойчивы три штамма (25%). Устойчивы к рифампицину (50 мкг/мл) – девять штаммов (87%). К критической концентрации этого препарата устойчивы три штамма M. intracellulare (25%).

Шесть штаммов M. kansasii (40%) устойчивы к концентрации стрептомицина 50 мкг/мл, девять (60%) - устойчивы к концентрации 10 мкг/мл. Три штамма (20%) устойчивы к концентрации изониазида 25 мкг/мл, три штамма (20%) - устойчивы к мкг/мл и девять штаммов M. kansasii (60%) устойчивы к критической концентрации этого препарата. Устойчивы к канамицину (50 мкг/мл) все штаммы (100%). Шесть штаммов M. kansasii (40%) устойчивы к этамбутолу (5 мкг/мл), шесть штаммов (40%) устойчивы только к концентрации 2 мкг/мл этого препарата. Три штамма (20%) чувствительны к этамбутолу. Устойчивы к рифампицину (50 мкг/мл) – 12 штаммов (80%). Три штамма M. kansasii (20%) чувствительны к этому препарату.

Штаммы M. scrofulaceum устойчивы к концентрации изониазида 25 мкг/мл, устойчивы к концентрации стрептомицина 10мкг/мл и устойчивы к критической концентрации этамбутола (2 мкг/мл). Штаммы M. scrofulaceum чувствительны к канамицину и рифампицину. Штаммы M. smegmatis устойчивы к максимальным концентрациям стрептомицина (50 мкг/мл), изониазида (25 мкг/мл) и рифампицина (50 мкг/мл); чувствительны к этамбутолу и канамицину. Штаммы M. gordonae устойчивы к концентрации стрептомицина 10 мкг/мл и изониазида 5 мкг/мл. Два штамма устойчивы к концентрации рифампицина 50 мкг/мл. Штаммы M. gordonae чувствительны к канамицину.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о высоком уровне устойчивости НТМБ к основным противотуберкулезным препаратам. В настоящее время методы тестирования лекарственной чувствительности in vitro разработаны только для M. tuberculosis. Существует необходимость разработки методов тестирования лекарственной устойчивости нетуберкулезных микобактерий.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.