WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

M. avium (n=31) - нефотохромогенные медленнорастущие микобактерии, образующие сухие, шероховатые (24 штамма – 77%) и гладкие, влажные колонии (штаммов – 23%). Все культуры росли на среде Левенштейна - Йенсена при 22С и 37С, у 22 из 31 исследованной культуры (71%) наблюдался рост при 45С, для всех культур характерна положительная каталазная, никотинамидазная и пиразинамидазная активность, отсутствие формамидазной активности, отсутствие способности использовать мочевину в процессе жизнедеятельности, отсутствие роста на среде с добавлением 5% NaCl, отрицательная нитратредуктазная активность (кроме одной культуры), у 23 из 31 культуры (74%) обнаружена термостабильная каталаза. Различий в микробиологических характеристиках между штаммами, выделенными от людей и от животных, найдено не было.

M. intracellulare (n=12) - нефотохромогенные медленнорастущие микобактерии, образующие сухие, шероховатые колонии. При биохимическом и бактериологическом иследовании получены следующие результаты: отсутствие роста на среде Левенштейна - Йенсена с добавлением 5% NaCl, рост при 22С и 37С, отсутствие роста при 45С, положительная каталазная, никотинамидазная и пиразинамидазная активность, отсутствие формамидазной активности, отсутствие уреазы, отрицательная нитратредуктазная активность, у 9 из 12 культур (75%) обнаружена термостабильная каталаза.

M. gordonae (n=3) - скотохромогенные медленнорастущие микобактерии, образующие гладкие, влажные колонии. Штаммы растут на среде ЛевенштейнаЙенсена при 22С и 37С, но не растут при 45С, добавление 5% NaCl в среду Левенштейна-Йенсена ингибирует их рост. Штаммы M. gordonae характеризуются положительной каталазной активностью, наличием термостабильной каталазы, отсутствием формамидазной, никотинамидазной и пиразинамидазной активности, отрицательной нитратредуктазной активностью. Уреаза выявлена только у одного штамма.

M. kansasii (n=15) - медленнорастущие штаммы, образующие сухие, шероховатые фотохромогенные колонии; растут при температуре 22С и 37С, рост при 45С отсутствует. Для всех культур характерна нитратредуктазная и уреазная активность. Рост на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl отсутствует.

Культуры характеризуются положительной каталазной активностью, наличием термостабильной каталазы, отсутствием формамидазной и пиразинамидазной активности. Положительная никотинамидазная активность выявлена у 6 штаммов M.

kansasii (40%).

M. scrofulaceum (n=4) - медленнорастущие штаммы, образующие скотохромогенные гладкие, влажные колонии. Культуры растут при температуре 22С и 37С, рост при 45С отсутствует. Рост на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl отсутствует. Культуры характеризуются положительной каталазной активностью, наличием термостабильной каталазы, способностью использовать мочевину в процессе жизнедеятельности. Отсутствие формамидазной и пиразинамидазной активности характерно для всех культур, а положительная нитратредуктазная и никотинамидазная активность выявлена только у одного штамма M. scrofulaceum.

Штамм M. ulcerans (n=1) характеризуется появлением отдельных сухих, шероховатых нефотохромогенных колоний через 5-6 недель после посева. Культура характеризуется отсутствием роста на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl, ростом при 22C, отсутствием роста при 37C и 45C, наличием термостабильной каталазы, отсутствием формамидазной, никотинамидазной и пиразинамидазной активности, отрицательной каталазной и нитратредуктазной активностью.

При биохимическом и бактериологическом исследовании M. smegmatis (n=2) выявлены следующие свойства культур: рост на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl, рост при 22С, 37С и 45С, появление отдельных нефотохромогенных гладких, влажных колоний менее чем через одну неделю после посева. Оба штамма используют никотинамид, формамид и мочевину в процессе метаболизма. Для них характерно наличие термостабильной каталазы, положительная нитратредуктазная и каталазная активность, отрицательная пиразинамидазная активность.

Для M. fortuitum (n=13) получены следующие результаты культуральных и биохимических тестов: рост при 22С и 37С, отсутствие роста при 45С, появление нефотохромогенных шероховатых, сухих колоний колоний менее чем через неделю после посева. На среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl рост отмечен у 6 культур из 13 (46%). Все анализированные культуры используют никотинамид, формамид и мочевину в процессе метаболизма. Положительная каталазная и нитратредуктазная активность, а также наличие термостабильной каталазы характерно для всех исследованных культур. Отрицательная пиразинамидазная активность выявлена только у трех штаммов M. fortuitum (23%). Различий в микробиологических характеристиках между штаммами, выделенными от людей и от животных, найдено не было.

Для культуры (n=1) M. peregrinum были получены следующие результаты культуральных и биохимических тестов: рост при 22С и 37С, отсутствие роста при 45С, появление нефотохромогенных шероховатых, сухих колоний менее чем через неделю после посева. Отмечен рост на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl. Для культуры характерны положительная никотинамидазная, формамидазная, уреазная и пиразинамидазная активность, положительная каталазная и нитратредуктазная активность, а также наличие термостабильной каталазы.

Для штамма M. chelonae/M. abscessus получены следующие результаты культуральных и биохимических тестов: рост при 22С и 37С, отсутствие роста при 45С, появление нефотохромогенных шероховатых, сухих колоний менее чем через одну неделю после посева, способность использовать пиразинамид, никотинамид, формамид и мочевину в процессе метаболизма, положительная каталазная активность, наличие термостабильной каталазы и отсутствие нитратредуктазной активности. Добавление 5% NaCl в среду Левенштейна-Йенсена ингибировало рост этой культуры.

Микробиологические методы тестирования сохраняют свою важность, так в случаях генетически близкородственных видов, как, например M. kansasii/M. gastri и M. ulcerans/M. marinum, имеющих сходные последовательности генов, но различающихся своими культуральными и биохимическими свойствами, рекомендуется применять сочетание генетических и микробиологических тестов.

В результате работы создана коллекция нетуберкулезных микобактерий, включающая 83 штамма, относящихся к десяти видам. Коллекцию можно использовать в качестве стандартной панели для определения видовой принадлежности клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий. Выявлено, что среди нетуберкулезных микобактерий, выделенных от больных легочной формой микобактериозов, проживающих в Центральном и Приволжском федеральных округах России преобладают виды M. avium-complex и M. kansasii.

Использование ПЦР-секвенирования гена 16S рРНК для видовой идентификации нетуберкулезных микобактерий.

В основе метода ПЦР-секвенирования гена 16S рРНК лежит амплификация участка гена 16S рРНК с последующим секвенированием двух гипервариабельных регионов. В результате ПЦР микобактериальной ДНК образуется фрагмент между 9 и 1036 положениями нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК в геноме референс-штамма M. tuberculosis H37Rv. Секвенирование амплификата осуществляли с использованием двух праймеров (Рис.

4). Нуклеотидная последовательность регионов A (150 п.н.) и B (70 п.н.) исследуемого штамма сравнивалась с известными последовательностями для разных видов.

При секвенировании фрагментов гена 16S рРНК у 27 штаммов НТМБ в гипервариабельном регионе А выявлены нуклеотидные замены в следующих позициях: 123/TC, 124/GA, 182/AT, 184/GA, 185/GA, 188/TC, 198/GC, 213/AT, 229/AG и делеция в позиции 210-211 CGCTC--T; в гипервариабельном регионе В обнаружена замена 461/CT. У четырех культур, кроме вышеперечисленных, обнаружена дополнительная замена 129/GA. Полученные результаты позволили отнести исследованные культуры к виду M. avium. Для этого вида характерна внутривидовая вариабельность последовательности 16S рРНК гена в 129 позиции.

У 12 штаммов НТМБ при секвенировании выявлены нуклеотидные замены в следующих позициях: 123/TC, 124/GA, 182/AT, 183/CT, 184/GT, 185/GA, 187/AG, 188/TC, 198/GC, 199/TA, 213/AT, 229/AG, 262/CT и делеция в позиции 210-211 CGCTC--T в гипервариабельном регионе А; в регионе В - замена 461/CT. По результатам секвенирования эти штаммы идентифицированы как вид M. intracellulare.

У двух исследованных культур НТМБ выявлены нуклеотидные замены в следующих позициях гена 16S рРНК: 124/GA, 138/TA, 173/GA, 184/GA, 188/TC, 189/GA, 196/TC, 213/AT, 229/AG, 262/CT и делеция в позиции 210-211 CGCTC--T в регионе А; в регионе В обнаружены замены 461/CT, 468/АG, 469/ T C. У одного штамма, в отличие от двух вышеуказанных культур, в 186 позиции обнаружена замена GA. По результатам секвенирования штаммы отнесены к виду M. gordonae, для которого характерна внутривидовая вариабельность в последовательности 16S рРНК гена.

При секвенировании фрагментов гена 16S рРНК у 15 штаммов НТМБ в регионе А обнаружены нуклеотидные замены в следующих позициях: 123/TC, 124/GA, 138/TA, 139/TC, 184/GT, 185/GT, 187/A G, 188/TC, 194/TC, 213/AT, 229/AG и делеция в позиции 210-211 CGCTC--T. Последовательность региона В идентична соответствующей последовательности M. tuberculosis-complex. Согласно полученным результатам культуры относятся к двум генетически близким видам M.

kansasii/M. gastri, имеющим одинаковую последовательность 16S рРНК гена.

У четырех культур НТМБ в регионе А гена 16S рРНК обнаружены замены в следующих позициях: 123/TC, 124/GA, 184/GT, 185/GT, 187/A G, 188/TC, 194/TC, 213/AT, 229/AG, 285/TA, 262/CT, и делеция в позиции 210-211 CGCTC--T. В регионе В замены 453-454/TCCT, 459-460-461/TTCACT, 463-464-465/CTCTGT, 468/АG, делеция позиций 456-457-458. Полученные результаты позволили отнести эти штаммы к виду M. scrofulaceum.

У одного штамма НТМБ выявлены замены в следующих позициях: 189/GT, 196/TC, 213/AT, 229/AG, 260/GA и делеция в позиции 210-211 CGCTC--T в регионе А; в регионе В обнаружены замены 454/CT, 461/CT. Согласно результатам эти штаммы принадлежат к виду M. ulcerans/M. marinum. У этих двух видов последовательность регионов А и В гена 16S рРНК одинакова.

При секвенировании фрагментов гена 16S рРНК у двух штаммов НТМБ обнаружены замены в следующих позициях: 140/CT, 173/GA, 181-182/CATG, 184/GT, 187-188/ATTC, 194/TG, 200/GA, 202/TG, 213/AT, 229/AG, 262/CT, делеция в позиции 210-211 CGCTC--T, замены и инсерция в позициях 177-178-179/GGACACC, 196-197/TTCTG в регионе А; замены 440/CG, 443444/TCCA, 452-453/GTCG, 455/CA, 469/TG, 478/GT, 482/GC, 491/CG и делеция 456-467 нуклеотидов в регионе В. Полученные результаты позволили отнести эти штаммы к виду M. smegmatis.

У одного штамма НТМБ в регионе А гена 16S рРНК выявлены замены в следующих позициях: 140/CT, 185/GC, 187/AC, 189/GT, 194-195196/TCTGTG, 213/AT, 229/AG, 260/GA, 262/CT, делеция в позиции 210211 CGCTC--T; замены 440-441/CCAT, 443-444/TCGG, 452-453/GTCG, 455/CA, 469/TG, 478-479/GGCC, 481-482/GGAT, 491/CG и делеция 456467 нуклеотидов в регионе В. У 12 штаммов НТМБ, кроме вышеперечисленных замен, обнаружены замены в позициях 173/GA и 177/GT. По результатам секвенирования эти штаммы относятся к виду M. fortuitum, для которого характерна внутривидовая вариабельность.

При секвенировании фрагментов гена 16S рРНК у одного штамма в регионе А обнаружены замены в следующих позициях: 140/CT, 173/GA, 177/GT, 182/AG, 185/GC, 186/GA, 187/AC, 189/GT, 191/AC, 194-195196/TCTGTG, 213/AT, 229/AG, 260/GA, 262/CT, делеция в позиции 210211 CGCTC--T; замены 440-441/CCAT, 443-444/TCGG, 452-453/GTCG, 455/CA, 469/TG, 478-479/GGCC, 481-482/GGAT, 491/CG и делеция 456467 нуклеотидов в регионе В. Полученные результаты позволили отнести исследованную культуру к виду M. peregrinum.

У одного штамма в регионе А гена 16S рРНК обнаружены замены в позициях 139/TC, 140/CT, 184-185-186-187/GGGAACAC, 189/GT, 194-195-196197/TCTTGTGA, 204/GC, 213/AT, 260/GA, 262/CT, делеция в позиции 210-211 CGCTC--T; замены 440-441/CCGT, 443-444/TCGG, 452-453-454455/GTCCCGAA, 469/TG, 478-479/GGCC, 481-482/GGAC, 491/CG и делеция 456-467 в регионе В. По результатам сиквенса гипервариабельных регионов 16S рРНК гена, культура была идентифицирована M. chelonae/M. abscessus. Эти два вида имеют одинаковую нуклеотидную последовательность гипервариабельных регионов А и В.

Таким образом, метод ПЦР-секвенирования гена 16S рРНК позволяет эффективно определять видовую принадлежность нетуберкулезных микобактерий.

Достоинства метода заключаются в высокой специфичности, быстром получении результатов анализа и возможности обнаружения ДНК единичных микобактериальных клеток в клиническом материале. Данный метод позволяет идентифицировать широкий спектр видов микобактерий, включая патогенные виды для человека и животных, а также сапрофитные микобактерии.

Исследование коллекции нетуберкулезных микобактерий рестрикционным анализом амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК.

В качестве альтернативного метода был использован метод рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК. Кроме определения видовой принадлежности нетуберкулезных микобактерий этот метод позволяет выявить внутривидовую вариабельность.

В полимеразной цепной реакции образцов ДНК, выделенных из 13 штаммов M.

fortuitum и одного штамма M. peregrinum получено несколько вариантов ПЦРпродуктов, различающихся по размеру (470-425 п.н.) и количеству (1 или 2) фрагментов спейсера 16S-23S рДНК (Табл. 1, Рис. 2).

У 7 штаммов амплифицируется два фрагмента спейсера 16S-23S рДНК. Шесть из них образуют ПЦР-продукт размером 470/425 п.н. и относятся к геногруппе M.

fortuitum I. Один штамм, образующий два фрагмента размером 450/425 пн, относится к геногруппе M. fortuitum II. У семи штаммов M. fortuitum амплифицируется один фрагмент спейсера 16S-23S рДНК. Штаммы, образующие амплификаты 470 п.н., отнесены нами к паттерну M. fortuitum X. Для дополнительного изучения пяти штаммов M. fortuitum, формирующих в результате ПЦР фрагмент 450 п.н., проведен рестрикционный анализ с использованием фермента HaeIII. Четыре штамма с рестрикционными профилями 220/140/100 п.н. обозначены нами как M. fortuitum Y и один штамм с профилем 240/220 п.н. - M. fortuitum Z (Табл. 1, Рис. 3).

М – маркер; 1 - M. fortuitum (470/425 п.н.);

2 - M. fortuitum (470/450 п.н.); 3 - M.

fortuitum (450 п.н.); 4 - M. fortuitum (п.н.); 5 - M. smegmatis (450 п.н.).

п.н.

М 1 2 3 4 Рис. 2. Электрофореграмма фрагмента спейсера 16S-23S рДНК различных быстрорастущих микобактерий.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.