WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Майорова Ангелина Александровна Идентификация нетуберкулезных микобактерий и выбор оптимальной комбинации методов для их видовой дифференциации.

03.00.07 – Микробиология А в т о р е ф е р а т диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва, 2007 г.

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич кандидат биологических наук Степаншина Валентина Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кочеровец Владимир Иванович доктор биологических наук Скотникова Ольга Ивановна.

Ведущая организация – Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН.

Защита состоится «» в _на заседании диссертационного совета в Федеральном государственном учреждении науки «Московский научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.

Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. адм. Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Московского научноисследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.

Габричевского

Автореферат разослан «» 2007 года Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук С.Ю. Комбарова 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В последние годы резко возросла частота заболеваний, вызываемых нетуберкулезными микобактериями (НТМБ). Главным образом это связано с увеличением количества людей, страдающих иммунодефицитами, в том числе СПИДом, а также с усовершенствованием методов идентификации микобактерий [Falkinham J.O. III, 1996; Bonard D. at al., 2004; Martn-Casabona N. at al., 2004].

Традиционно микобактериозы не относят в группу опасных инфекций, так как считается, что они не передаются от человека к человеку [Зыков М.П., Ильина Т.Б., 1978; Falkinham J.O. III, 1996]. Однако эти заболевания могут протекать очень тяжело, нередко приводя к летальному исходу [Зыков М.П., Ильина Т.Б., 1978; Грузевский А.А., 1999].

Заболевания, вызываемые нетуберкулезными микобактериями, у больных без серьезных нарушений иммунной системы, обычно ограничиваются поражением легких, лимфы или кожи [Falkinham J.O. III, 1996]. Диссеминированные формы микобактериозов у них встречаются редко. Микобактерии часто поражают легкие у людей, страдающих хроническими заболеваниями - пневмокониозом, силикозом, бронхоэктазами, саркоидозом, коллагенозом и другими заболеваниями [Зыков М.П., Ильина Т.Б., 1978; Marras T.K. at al., 2002; Ergin A. at al., 2004]. Нетуберкулезные микобактерии могут быть причиной послеоперационных осложнений или травм [Falkinham J.O. III, 1996]. Микобактериозы по своей клинической картине и течению очень похожи на заболевания, вызываемые микобактериями туберкулеза [Зыков М.П., Ильина Т.Б., 1978; Ellis S.M. at al., 2002].

Нетуберкулезными микобактериями инфицировано от 25 до 50 % больных СПИДом в США и Европе [Falkinham J.O. III, 1996]. Риск развития микобактериозов и бактериемии в отсутствии профилактики у ВИЧ - инфицированных больных составляет 10-20% в год [Holland SM., 2001]. У пациентов со СПИДом обычно развиваются диссеминированные формы микобактериозов, что также является следствием имммунодифицитного состояния [Falkinham J.O. III, 1996].

Род Mycobacterium включает около 100 охарактеризованных видов [Primm T.P.

at al., 2004; Katoch V.M., 2004]. Описано более 20 видов нетуберкулезных микобактерий, способных вызывать заболевания человека [Ellis S.M. at al., 2002].

Различные нозологические формы заболеваний могут быть вызваны одним видом и, наоборот, причиной сходных по клиническим проявлениям заболеваний могут быть разные виды микобактерий [Ellis S.M. at al., 2002]. Следовательно, для лечения микобактериозов требуются разные схемы лечения [Heginbothom M.L, 2001].

Своевременное выявление заболевания и адекватная терапия являются необходимыми условиями успешного выздоровления пациента. Однако, к настоящему времени не существует универсальных методов для быстрой и дешевой идентификации нетуберкулезных микобактерий.

Цель работы.

Идентификация клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, циркулирующих в Центральном и Приволжском федеральных округах России и выбор оптимальной комбинации методов для определения видовой принадлежности.

Задачи исследования.

1. Охарактеризовать штаммы нетуберкулезных микобактерий с помощью культуральных и биохимических методов.

2. Провести видовую идентификацию штаммов НТМБ с помощью молекулярногенетических методов.

3. Оценить дифференциально-диагностическую способность отдельных методов для идентификации микобактерий.

4. Определить лекарственную устойчивость клинических и лабораторных штаммов нетуберкулезных микобактерий к основным противотуберкулезным препаратам.

5. Создать коллекцию клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, охарактеризованных культуральными, биохимическими и молекулярногенетическими методами.

Научная новизна работы. Предложены комплексы методов для идентификации нетуберкулезных микобактерий: 1) ПЦР-секвенирование гена 16S рРНК, 2) рестрикционный анализ амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК и 3) высокопроизводительная жидкостная хроматография миколовых кислот (high performance liquid chromatography - HPLC). В случаях генетически близкородственных видов, как, например M.

kansasii/M. gastri и M. ulcerans/M. marinum, имеющих сходные последовательности генов, но различающихся своими микробиологическими свойствами, рекомендуется применять сочетание генетических и микробиологических тестов. Создана коллекция нетуберкулезных микобактерий. Определена лекарственная устойчивость штаммов нетуберкулезных микобактерий к основным противотуберкулезным препаратам.

Впервые проведено изучение клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, полученных от больных, проживающих в Центральном и Приволжском федеральных округах России, с помощью как традиционных микробиологических, так и современных молекулярно-генетических методов.

Практическое значение работы. Создана коллекция нетуберкулезных микобактерий, включающая 83 штамма, относящихся к десяти видам, которую можно использовать в качестве стандартной панели для определения видовой принадлежности клинических штаммов. Проведен анализ ряда основных методов, позволяющих осуществлять идентификацию НТМБ и их внутривидовую дифференциацию. Своевременная идентификация позволяет назначать больным, как туберкулезом, так и микобактериозами адекватную схему лечения или вносить в нее коррективы в течение нескольких суток.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Проведена сравнительная характеристика методов, используемых для идентификации НТМБ (ПЦР-секвенирование гена 16S рРНК, рестрикционный анализ амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК и HPLC) для применения в повседневной практике. Применение культуральных и биохимических тестов и ПЦР-секвенирование гена 16S рРНК в 99 % случаев позволяет определить видовую принадлежность НТМБ.

2. Обнаружена внутривидовая вариабельность вида M. fortuitum. При использовании метода рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК выявлено пять геногрупп данного вида микобактерий.

3. При определении лекарственной устойчивости клинических и лабораторных штаммов НТМБ к основным противотуберкулезным препаратам – стрептомицину, изониазиду, канамицину, этамбутолу и рифампицину выявлена высокая устойчивость к этим препаратам.

4. Выявлено, что среди НТМБ, выделенных от больных легочной формой микобактериозов, проживающих в Центральном и Приволжском федеральных округах России, преобладают виды M. avium, M. intracellulare и M. kansasii.

Создана коллекция НТМБ, включающая 83 штамма, относящихся к десяти видам.

Апробация работы. Результаты работы доложены на заседании Ученого Совета ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, 26 января 2007 г. Результаты работы обсуждены на VII Российском съезде фтизиатров (Россия, Москва, 2003 г.) и на VII межгосударственной научнопрактической конференции (Россия, Оболенск, 3-5 октября 2006 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы, в том числе две работы в изданиях, рекомендованных ВАК России.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 11 работ отечественных и 147 работ зарубежных авторов. Работа содержит 13 рисунков и 14 таблиц.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы.

Всего в работе использовано 103 штамма микобактерий. Лабораторные штаммы M. fortuitum, M. chelonei, M. scrofulaceum, M. gordonae, M. avium, M.

smegmatis (M), M. smegmatis (Н), M. bovis 1, M. bovis 2, M. bovis 3 и 54 клинических штамма, выделенных от людей предоставлены Медведевой И.М. (Московская медицинская академии имени И.М.Сеченова). Штаммы НТМБ выделены от больных (возрастная группа 56-84 лет), находившихся на учете в региональных туберкулезных диспансерах на протяжении 3-7 лет. Периодически, при обострении заболевания, больные получали стандартное противотуберкулезное лечение. Это были пациенты с затяжными, трудно поддающимися лечению заболеваниями легких. Все они, согласно историям болезни, имели диагноз туберкулез легких (различные формы). Диагноз подтвержден рентгенологически.

Шесть штаммов НТМБ получены от Ильиной Е.А. (областной противотуберкулезный диспансер, г. Нижний Новгород), которые были выделены из мокроты пациентов с предварительным диагнозом – микобактериоз. В работе исследованы штаммы, полученные от Левачевой В.А., выделенные из мокроты пациентов с диагнозом туберкулез легких из областного противотуберкулезного диспансера, г. Тула. Тринадцать штаммов нетуберкулезных микобактерий, выделенных от животных (крупного рогатого скота и свиней) получены из Научноисследовательского ветеринарного института (г. Нижний Новгород) от Лазовской А.Л. Лабораторные референс-штаммы M. tuberculosis H37Rv, M. gordonae, M.

fortuitum и M. ulcerans были любезно предоставлены доктором Barry Clifton III (National Institutes of Health, MD, USA). Штамм M. bovis BCG получен из ГИСКа имени Тарасевича. Для культивирования микобактерий использовали среду Левенштейна-Йенсена. Культуру хранили в лактозно-глицериновой защитной среде при температуре -70С.

Микробиологическую идентификацию микобактерий проводили в соответствии с приказом № 109 от 21 марта 2003 г. Учитывали скорость роста культуры при 37°C, способность к росту при 22°C, 45°C, а так же морфологию и цвет колоний, использовали тест на определение способности микобактерий к росту на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей 1000 мкг/мл салицилово-кислого натрия, 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты, 5% хлористый натрий. Ниациновый тест проводился согласно методике, предложенной Кубиком и Кильбурном, в модификации Бараускене. Способность микобактерий использовать амиды (мочевину, никотинамид и пиразинамид) в процессе метаболизма определяли по методу Такэ. Наличие формамидазной активности проверяли по модифицированной методике Дыхно.

Активность и термостабильность каталазы определяли по методикам Kent P. T.

et al., 1985. Определение нитратредуктазной активности осуществляли по методу Грисса [Методические рекомендации по проведению микробиологических исследований на туберкулез. М., 2001]. Определение уровней устойчивости штаммов НТМБ к стрептомицину, изониазиду, рифампицину, канамицину и этамбутолу на среде Левенштейна-Йенсена проводили методом абсолютных концентраций [Приказ № 109].

Выделение хромосомной ДНК осуществляли по методу Маниатис Т. и др., 1984. Наличие инсерционного элемента IS6110 выявляли амплификацией с использованием праймеров, нуклеотидная последовательность которых опубликована в работе Dubiley S. et al., 2005. Сполиготипирование выполняли по методике Kamerbeek J., Schouls L., et al. 1997. ПЦР – секвенирование фрагмента гена, кодирующего синтез 16S рРНК выполняли по методике Kirschner P. et al., 1998.

Метод рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рДНК осуществляли по методике Lappayawichit P. et al., 1996. HPLC выполняли по методике Butler W.R. et al, 2001.

Результаты исследования и их обсуждение.

Дифференциация культур на нетуберкулезные микобактерии и микобактерии туберкулезного комплекса.

Нетуберкулезные микобактерии в отличие от микобактерий туберкулёзного комплекса растут на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей салициловокислый натрий или р-нитробензойную кислоту. Инсерционный элемент IS6110 присутствует в геномах штаммов только туберкулезного комплекса, что позволило нам использовать его в качестве маркера для дифференциации туберкулезных и нетуберкулезных микобактерий (Рис 1). Микобактериальные культуры (n=83), которые выросли на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением салицилата натрия и паранитробензойной кислоты, и в геномах которых отсутствовал элемент IS6110, были отнесены в группу НТМБ.

1000 п.н.

М – маркер; 1 - M. tuberculosis H37Rv; 2, 3 – клинические штаммы из областного противотуберкулезного диспансера, г. Тула; 4 - M. bovis B-D; 5 - M. bovis B-R; 6 - M. bovis B-1;

7 - M. gordonae; 8 - M. fortuitum; 9 - M. ulcerans.

М 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 1. Результаты электрофоретического разделения продуктов ПЦР с ДНК, выделенной из микобактерий.

Таким образом, проведенные исследования показали, что как микробиологические, так и молекулярно-генетические методы позволяют эффективно дифференцировать микобактерии на туберкулезные и нетуберкулезные.

Культуральные и биохимические характеристики штаммов НТМБ.

При анализе штаммов НТМБ учитывались следующие характеристики:

морфология и пигментация колоний, рост при 22С, 37С, 45С, скорость роста, рост на среде с 5% NaCl, определение каталазной амидазной и нитратредуктазной активности, определение термостабильной каталазы.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.