WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

СВЧ-облучение. Обработку СВЧ-излучением суспензий чистых микроорганизмов и воздушно-сухих образцов почвы проводили при частоте МГц, длине волны 12,5 см, мощности 80 Вт и времени облучения 15, 30, 45, 60 и секунд. При проверке одной из гипотез возможного механизма действия ЭМИ на клетку перед облучением создавали бескислородную среду, вытесняя кислород аргоном в пенициллиновом флаконе со споровой суспензией культуры актиномицета.

Определение биомассы. Биомассу цианобактерий и зеленых микроводорослей определяли нефелометрическим методом (ФЭК-М). Для пересчета показаний ФЭКа были построены стандартные кривые зависимости веса сухой биомассы от величины экстинкции Е. Биомассу актиномицетов определяли весовым методом.

Определение уровня дыхания. Для оценки уровня дыхания актиномицетных культур, измеряли эмиссию СО2 на газовом хроматографе Хром 3700 с детектором по теплопроводности после инкубации 5 мл суспензии в течении часа при температуре 28° С [Звягинцев, 1991]. Расчёты производили по формуле:

D = S*K*Vг./Vп.*t*Vж.ф., где D – эмиссия СО2 (мкг С- СО2 / мл*час); S – площадь пика; K – коэффициент пересчёта K = 1,29*10-11; Vг. – объём газовой фазы (мл),Vг.=10; Vп. – объём пробы (мл),Vп.= 0,5; t – время инкубации (часы), t = 1; Vж.ф. – объём жидкой фазы (мл), Vж.ф. = 5.

Определение реакционной способности (РС). Реакционную способность (РС, окислительную - ОА и антиокислительную - АОА активность) определяли методом химических моделей [Тамбиев, 1974; 1984], в качестве модели использовали 3,4-диоксифенилаланин (ДОФА). ОА и АОА определяли соответственно по повышению или понижению скорости реакции окисления ДОФА в контроле (чистая среда) и при добавлении культуральной жидкости, содержащей нативные экзометаболиты. Ускорение или торможение реакции окисления ДОФА культуральной жидкостью по сравнению с чистой средой определялось тангенсом угла наклона кривой нарастания оптической плотности во времени при постоянной температуре 45° С на приборе Аквакон-4. Раствор ДОФА готовится в следующих отношениях: на 25 мл дистиллированной Н2О вносится 10 мг реактива ДОФА.

Мультисубстратное тестирование. Изменение усвоения различных субстратов актиномицетами после действия СВЧ-излучения определяли методом мультисубстратного тестирования (МСТ). Он основан на инкубации микроорганизмов в присутствии 47 различных субстратов при 28C и определении степени их усвоения по интенсивности окраски, обусловленной трифенилформазаном – продуктом восстановления бромистого трифенилтетразолия (индикатора метаболизма) дыхательными ферментными системами актиномицетов, который добавлялся в каждую пробу в составе фосфатного буфера [Горленко, Кожевин, 1994;

Зенова и др., 2001].

Определение размера актиномицетных колоний. Размер актиномицетных колоний определяли после точечного посева инокулята на твердую питательную среду с последующем измерением диаметра колоний в процессе роста культуры.

Изучение таксономического положения выделенных культур актиномицетов. Для идентификации культур актиномицетов использовали их морфологические признаки [Гаузе и др.,1983]. Описание проводили на следующих диагностических средах: минеральный агар 1 Гаузе; органический агар 2 Гаузе;

овсяный агар; глицерин-нитратный агар; пептонно-дрожжевой агар с железом.

Условия культивирования смешанной культуры актиномицета Str.

xanthochromogenes и цианобактерии A. variabilis. Для культивирования смешанной культуры нами впервые подобрана модифицированная среда, которая представляет аналог минеральной среды Громова №6 с добавлением растворимого крахмала в количестве 8 г/л. В качестве инокулята использовалась споровая суспензия актиномицета, концентрация спор в суспензии составляла 106 клеток на мл.

Концентрация клеток цианобактерии составляла 104 клеток на мл. Соотношение аликвот каждого компонента на 200 мл среды составляет 2:1 актиномицетной и цианобактериальной части соответственно. Оптимальными условиями культивирования является первоначальное качание в течение 2 суток в темноте при 180 об/мин и температуре 28° С, что требуется для прорастания спор и начала логарифмической фазы роста актиномицета. Дальнейшее совместное культивирование проводилось при постоянном качании (60 об/мин) и освещении (16,4 mol m-2 s-1) при той же температуре.

Изучение морфологических особенностей культур микроорганизмов.

Изучение морфологических особенностей микроорганизмов проводилось при помощи оптического микроскопа Axiophot, фирмы Carl Zeiss.

Статистическая обработка. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента [Лакин, 1968]. При статистической обработке данных использовался доверительный интервал [Дмитриев, 1995]. В случае невозможности аппроксимации изучаемого распределения нормальным законом применялись непараметрические методы анализа, в частности критерий Вилкоксона [Благовещенский, 1985].

Статистическая обработка данных и математический анализ осуществлен с использованием программ Excel 2003, Statistica 6.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Применение обработки СВЧ-излучением воздушно-сухих образцов для выделения редких родов актиномицетов. В результате исследований было установлено, что СВЧ-излучение подавляет жизнеспособность широко распространенных в почве видов бактерий Micrococcus sp., Bacillus sp. и Pseudomonas sp., начиная с 30 секундной обработки суспензий, при этом значительного нагревания объектов не происходит.

СВЧ-облучение воздушно-сухих образцов почвы позволило заметно увеличить (на 10%) долю выделяемых из почвы редких родов актиномицетов при 45 секундной экспозиции (рис. 1). Из полученных нами результатов можно предположить, что доля редких родов актиномицетов возрастает не за счёт угнетения широко распространённых в почве стрептомицетов, а в связи с подавлением конкурирующих с актиномицетами немицелиальных бактерий и возможной стимуляции роста некоторых видов актиномицетов.

необлучённая почва 26,23% редкие 73,77% Streptomyces Обработка СВЧ-излучением в течение 45 секунд 36,2% редкие 63,8% Streptomyces Рис. 1. Доля редких родов актиномицетов при выделении их из почвы с использованием СВЧ-облучения и без него Данный метод предварительной обработки почвы является быстрым и лёгким в исполнении, не мешает дальнейшей работе с почвенными образцами, позволяет более полно оценивать актиномицетный комплекс в почвах, а также облегчает задачи при изыскании редких родов и видов актиномицетов, столь важных для биотехнологической и фармакологической промышленности.

Изменения физиологических характеристик у актиномицетов под действием СВЧ- и КВЧ-излучения. Изучение действия СВЧ-излучения на физиологические параметры актиномицетов проводилось на споровых суспензиях культур Str. xanthochromogenes и Str. cinereorectus, так как актиномицеты представлены в почве в значительной степени в форме покоящихся спор. В качестве основных физиологических характеристик рассматривались: сохранение жизнеспособности (по КОЕ/мл), накопление биомассы, уровень дыхания, РС культуральной среды и мультисубстратное тестирование.

Впервые для актиномицетов, в частности для Str. xanthochromogenes было установлено стимулирующее действие СВЧ-излучения при 30 секундной экспозиции, заключающееся в увеличении накопления биомассы на 21%, уровня дыхания на 20% и РС на 15% (ОА) с максимумом у 38-часовой культуры (рис.2,3).

0,0,К 0,0,0,0,0,0,0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 время роста, ч 15, 30, 45, 60, 90 - время облучения (секунды) К - необлученная культура Рис. 2. Накопление биомассы у актиномицета Str. xanthochromogenes после СВЧоблучения споровой суспензии биомасса, г/100мл К 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 время роста, ч 15, 30, 45, 60, 90 - время облучения (секунды) К - необлученная культура ОА, АОА в % к чистой среде, (контролю) Рис. 3. Изменение РС у актиномицета Str. xanthochromogenes после СВЧоблучения споровой суспензии Исследования с актиномицетом Str. cinereorectus показали схожую картину действия СВЧ-излучения, однако стимуляция физиологических характеристик была менее выражена.

Учитывая, что актиномицеты являются микроорганизмами со сложным жизненным циклом, представляло интерес выяснить, как будет вести себя культура при посеве облучённым СВЧ-излучением мицелием. В результате, для актиномицета Str. xanthochromogenes показано, что, в отличие от спор, действие излучения начинается при более длительных экспозициях – 60 и 90 секунд, при этом происходит ускорение развития культуры с кульминацией к 38 часам роста, как по накоплению биомассы, так и по изменению РС (рис. 4, 5). Можно предположить, что в спорах находится меньшее количество антиокислителей, чем в растущем мицелии, которые могут влиять на развитие первичных механизмов действия СВЧ-излучения [Тамбиев и др., 2003]. Несмотря на большую устойчивость спор к внешним воздействиям, нами установлена необходимость более длительного СВЧ-облучения мицелия актиномицета по сравнению со споровой суспензией для достижения схожего эффекта стимуляции роста культуры.

ОА % АОА % 0,0,0,0,К 0,0,0,0,0 10 20 30 40 50 60 70 время роста, ч Рис. 4. Накопление биомассы у актиномицета Str. xanthochromogenes после СВЧоблучения суспензии мицелиальных клеток К 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 время роста,ч Рис. 5. Изменение РС у актиномицета Str. xanthochromogenes после СВЧоблучения суспензии мицелиальных клеток Методом мультисубстратного тестирования (МСТ) изучено возможное изменение метаболической активности по отношению к субстратам при действии СВЧ-излучения на споровую суспензию актиномицета Str. xanthochromogenes, что приводит к сокращению спектра усваиваемых веществ. В необлученном варианте происходит усвоение 7 субстратов: L-глутамина, аспарагина, мочевины, аспартата, биомасса, г/100мл ОА% АОА% гистидина, серина, лактата. После облучения прекращается усвоение лактата, что может говорить об угнетении синтеза лактозы. В то же время, возрастание метаболической активности по отношению к ряду субстратов, например к аспарагину, более всего изменяется после 30 секундного облучения, что подтвердил проведенный кластерный анализ.

Одна из гипотез механизма действия ЭМИ на клетки микроорганизмов говорит о значимости присутствия О2 в среде [Тамбиев и др., 2003]. Мы облучали СВЧизлучением суспензию спор Str. xanthochromogenes в воде, где кислород вытеснялся аргоном. В результате наблюдалось снижение действия СВЧ-излучения, что проявлялось в уменьшении стимулирующего эффекта на этом штамме.

Следующим этапом нашей работы стало изучение действия КВЧ-излучения на актиномицеты. В ходе экспериментов были исследованы следующие характеристики:

сохранение жизнеспособности спор (по КОЕ/мл), накопление биомассы и радиальная скорость роста колоний. После КВЧ-облучения (длина волны 7,1 мм, длительность 15, 30 минут) наблюдалось увеличение диаметра колоний приблизительно на 40%, начиная с 4 суток роста по сравнению с необлученной культурой (рис. 6).

1530 К К 15 К 45 К 45 К 2 сутки 3 сутки 4 сутки 7 сутки 10 сутки время роста, сутки Рис. 6. Действие КВЧ-излучения при длине волны 7,1 мм на размер колоний актиномицета Str. xanthochromogenes диаметр колонии, мм Изучение смешанных культур. Для создания смешанных культур были использованы актиномицеты Str. xanthochromogenes и Str. cinereorectus (гетеротрофный), а также цианобактерия A. variabilis и зеленая микроводоросль Sc.

quadricauda (фототрофный компонент).

В ходе исследований было апробировано большое количество сред для совместного культивирования этих микроорганизмов. Установлено, что наиболее удачной является модифицированная нами минеральная среда Громова №6 с добавлением крахмала из расчета 8 г/л. Оптимальные условия культивирования состояли в первоначальном качании в темноте при температуре 28°С (2 суток, об/мин.), что требуется для прорастания спор и начала логарифмической фазы роста актиномицета, и дальнейшем качании при постоянном освещении культуры (16,4 mol m-2 s-1).

В этих условиях нам удалось получить устойчивый и наиболее активный рост смешанной культуры актиномицета Str. xanthochromogenes и цианобактерии A.

variabilis. Другие три смешанные культуры: Str. cinereorectus + A. variabilis; Str.

xanthochromogenes + Sc. quadricauda; Str. cinereorectus + Sc. quadricauda по характеру роста и накоплению биомассы можно отнести к менее подходящим сочетаниям. У двух пар мы наблюдали угнетение роста.

Критерий при подборе пар для смешанных культур микроорганизмов. Как возможный критерий при подборе пар для смешанных культур нами было предложено рассмотреть РС нативных экзометаболитов, выделяемых в среду микроорганизмами, что описано для ряда объектов [Тамбиев, 1974; 1984].

При культивировании A. variabilis на модифицированной среде Громова №наблюдается увеличение антиокислительной активности (АОА) среды до 7 суток роста, затем снижение и переход в окислительную активность (ОА) на 14 сутки роста.

Для актиномицета Str. xanthochromogenes на той же среде РС имеет ОА на всем протяжении роста культуры (рис. 7), с максимумом на 3 сутки роста, когда увеличение ОА составляет около 180% к контролю. Для смешанной культуры этих микроорганизмов мы наблюдали зависимость результирующей кривой РС до 3-суток роста от быстрорастущего гетеротрофного партнера, которая на 4-5 сутки сменялась зависимостью от экзометаболитов медленно растущего фототрофного партнера.

0 3 6 9 12 15 18 сутки роста Streptomyces xanthochromogenes шт.№Anabaena variabilis Смешанная культура Рис. 7. Изменение РС в процессе роста смешанной культуры Str.

xanthochromogenes и A. variabilis, и отдельно у её партнеров Для Sc. quadricauda выявлена ОА экзометаболитов в процессе роста культуры на модифицированной среде Громова №6 и увеличение происходит до 12 суток роста.

Аналогичный ход кривой в ОА наблюдаем и для актиномицета Str. cinereorectus, с максимумом около 155% у 3 суточной культуры. В смешанной культуре этих микроорганизмов наблюдался ход кривой РС, как результирующий от двух кривых отдельно взятых партнеров (рис. 8).

Полученные данные показали, что наиболее подходящие пары изученных микроорганизмов при культивировании на одинаковой среде обладают противоположной РС культуральной жидкости, то есть ОА и АОА, и чем значительней разница между ними, тем более совместимыми партнеры оказываются в смешанной культуре. Таким образом, определение РС нативных экзометаболитов культуральной жидкости у отдельных культур – предполагаемых партнеров для ассоциативных пар и смешанных культур, возможно использовать как экспресскритерий при их создании.

Pages:     | 1 || 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.