WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

ЛУБЯНОВ Александр Александрович МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ РЕГУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ СТИФУНА И ЕГО ПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА В УСЛОВИЯХ КАДМИЕВОГО СТРЕССА Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа – 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Научный консультант: кандидат биологических наук Яхин Олег Ильдусович Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Кузнецов Виктор Васильевич доктор биологических наук, доцент Баймиев Алексей Ханифович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится «_» 2009 г. в «» часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 002.133.01 при ИБГ УНЦ РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71), с авторефератом – на сайте www.anrb.ru/molgen/dissov.html

Автореферат разослан «» 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Бикбулатова С.М.

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. К настоящему времени накоплен большой объем информации о фитотоксическом действии тяжелых металлов (ТМ) [Феник и др., 1995;

Барсукова, 1997; Sanita di Toppi, Gabrielli, 1999; Hall, 2002]. В связи с широким распространением в биосфере ТМ в результате естественных природных процессов и антропогенной деятельности актуален поиск средств, уменьшающих как негативное действие ТМ на рост культурных растений, так и их накопление в растениеводческой продукции. Следует отметить значительный рост в последние годы количества публикаций, в которых обсуждается возможность модификации действия тяжелых металлов на культурные растения при применении регуляторов роста [Башмаков 2002;

Лукаткин и др., 2003; Kaur, Bhardwaj, 2003; Серегина, 2004; Ульяненко и др., 2004; Janeczko et al., 2005; Drazic et al., 2006; Sharma, Bhardwaj, 2007 и др.].

Установлены протекторные свойства регуляторов роста растений в условиях токсического действия ТМ, при применении некоторых из них выявлено уменьшение накопления тяжелых металлов. С другой стороны применение ряда соединений в условиях действия ТМ может напротив приводить к усилению накопления и/или токсического действия металлов на растения. Таким образом, исследование механизмов действия регуляторов роста растений в условиях стресса, вызываемого ТМ, в настоящее время является актуальным.

В Институте биохимии и генетики УНЦ РАН разработан препарат стифун - регулятор роста растений с антистрессовой активностью на основе метаболитов растений семейства злаковых [Патент РФ № 2076603, 1997].

Показано, что стифун обладает ростстимулирующим действием, выраженными фунгицидными свойствами, способностью повышать устойчивость растений к водному дефициту и хлоридному засолению [Яхин, 1999; Yakhin et al., 1998, 1999, 2000].

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы – установление механизмов действия стифуна и его протекторных свойств в условиях кадмиевого стресса.

Были поставлены следующие задачи:

– оценить влияние стифуна на процессы деления и растяжения клеток, морфологические характеристики ядрышек меристематических клеток, содержание свободных аминокислот, эндогенных фитогормонов АБК, ИУК и различных форм цитокининов у растений пшеницы;

– провести цитогенетический анализ действия стифуна на растениях Allium fistulosum;

– исследовать ответные реакции растений пшеницы в условиях действия токсических концентраций ацетата кадмия при применении стифуна, оценивая влияние на морфометрические параметры, митотическую активность и элонгацию клеток, содержание фитогормонов, а также провести цитогенетическую оценку действия кадмия (Cd) при применении данного регулятора роста на растениях лука-батуна;

– изучить влияние стифуна на распределение кадмия в тканях и его аккумуляцию у растений кукурузы, пшеницы, риса;

– оценить влияние стифуна на экспрессию гена фитохелатинсинтазы риса PCSпри действии кадмия.

Научная новизна. Результаты исследований вносят вклад в понимание механизмов действия регулятора роста растений стифуна. Активация роста растений под его влиянием обусловлена усилением интенсивности деления и растяжения клеток. Важную роль в проявлении рострегулирующего действия стифуна играет изменение содержания цитокининов - изопентениладенозина, зеатина, зеатинрибозида, дигидрозеатинрибозида. В условиях токсического действия ацетата кадмия применение стифуна и эпина-экстра приводит к уменьшению уровня хромосомных нарушений, стифун стабилизирует митотическую активность растительных клеток. Стифун и эпин-экстра уменьшают поглощение кадмия у растений кукурузы, пшеницы, риса.

Снижение содержания кадмия в побегах риса под влиянием стифуна при экспозиции проростков на растворе ацетата кадмия сопровождается меньшей экспрессией гена фитохелатинсинтазы PCS1.

Практическая значимость работы. Выявлена способность биорегуляторов стифуна и эпина-экстра повышать устойчивость культурных растений к токсическому действию кадмия и уменьшать его аккумуляцию в растениях.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на 2-й Всеукраинской конференции молодых ученых (Харьков, 2001), Международной конференции «Стедентська молодь і науковий прогрес в АПК» (Львов, 2001), 6-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2002), X международном конгрессе IUPAC (Basel, 2002), XIII конгрессе FESPB (Heraclion, 2002), конференции «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), международной научно-практической конференции «Пути повышения эффективности АПК в условиях вступления России в ВТО» (Уфа, 2003), V и VI съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003; Сыктывкар, 2007), II международной конференции «Онтогенез растений в природных и измененных условиях окружающей среды: физиологические, биохимические и экологические аспекты» (Львов, 2004), международной научной конференции «Фитопатогенные бактерии. Фитонцидология. Аллелопатия» (Киев, 2005), международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006), IV международной научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы современной биологии» (Алматы, 2006), школе-семинаре молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликована 21 печатная работа, в том числе 4 статьи в журналах, включенных в перечень, рекомендуемый ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы. Работа изложена на 155 страницах, содержит 8 таблиц и 30 рисунков. Список литературы включает 283 наименования.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объекты исследований - растения Zea mays L. сорта Жемчуг, Allium fistulosum L. сортов Грибовский и Русский зимний, Triticum aestivum L. сортов Жница и Ирменка, Oryza sativa L. сорта Рапан.

В работе использовали регулятор роста с антистрессовой активностью стифун (препаративная форма – водорастворимый порошок), получаемый по оригинальной технологии [Патент РФ № 2076603, 1997] в группе биологически активных соединений лаборатории молекулярных механизмов устойчивости растений к стрессам Института биохимии и генетики УНЦ РАН к.б.н. И.А.

Яхиным. Стифун применяли в диапазоне концентраций 0.00033 – 3300 мг/л, салициловую кислоту (СК) - 0.01 мМ; 0.1мМ; 1 мМ (Sigma, США), эпин–экстра (д.в. эпибрассинолид - 25 мг/л) – 0.03 мл/л – 0.5 мл/л (ННПП «НЭСТ М», Россия). Ацетат кадмия использовали в диапазоне концентраций 0.0001 мМ – 10 мМ. Контроль – дистиллированная или водопроводная вода, а при гистохимическом определении кадмия – бидистиллированная вода.

Семена растений перед посевом стерилизовали в 70%-ном этаноле. В работе использовались различные способы применения биорегуляторов:

обработка семян или проростков пшеницы, кукурузы, риса их водными растворами в течение 60, 120 мин, проращивание семян в чашках Петри на фильтровальной бумаге, увлажненной раствором биорегулятора в течение 2, 3, 4 сут при 240С – 270С, выращивание растений в водной культуре в течение сут на плотиках из пробкового материала с отверстиями, на которые размещали проклюнувшиеся семена, предварительно проращенные в термостате в течение 24 часов при температуре 240С. Применение ацетата кадмия включало экспозицию растений на его растворах в течение 2, 3, 4, 5 сут. При установлении зависимости «время-эффект» перед экспозицией на растворе ацетата кадмия 2 сут растения лука-батуна обрабатывали биорегуляторами в течение 1 ч, в экспериментах «доза-эффект» использовали экспозицию на растворе биорегулятора, а также совместную экспозицию с ацетатом кадмия.

В опытах определяли линейные размеры, массу корней, побегов и проводили цитологический анализ процессов деления, оценивая митотическую активность меристематических клеток растений пшеницы по методике [Паушева, 1988], лука-батуна – согласно [Методические рекомендации…, 1992], а также растяжения клеток, учитывая клетки, закончившие рост. При анализе анафазных пластинок выявляли общий уровень аберраций и спектр структурных нарушений хромосом: хроматидные и хромосомные фрагменты, одиночные и парные мосты, отставания хромосом [Методические указания, 1992] и другие встречающиеся нарушения. При оценке морфологических характеристик ядрышек использовали метод окрашивания азотнокислым серебром [Bloom, Goodpasture, 1976; Архипчук и др., 1992]. В цитологических экспериментах использовали световой микроскоп Amplival («Carl Zeiss», Германия) и цифровой фотоаппарат Olympus CAMEDIA C-460 (Индонезия).

Гистохимическое определение локализации кадмия в живых тканях растений с использованием дитизона в качестве специфического реагента проводили по методу Серегина и Иванова (1997). Количественное определение кадмия проводили на атомно-абсорбционном спектрофотометре с пламенным атомизатором ААS-30 («Carl Zeiss», ГДР).

Количественное определение свободных аминокислот проводили с использованием аминокислотного анализатора «Hitachi 835» (Япония).

Содержание свободных форм фитогормонов цитокининов, абсцизовой и индолилуксусной кислот в растениях пшеницы определяли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) [Кудоярова и др., 1986, 1990;

Веселов, 1990, 1998; Шакирова и др., 1990]. При анализе форм цитокининов использовали экстракционную очистку и тонкослойную хроматографию в системе растворителей (n-)бутанол:аммиак:вода (6:1:2) [Arkhipova et al., 2005].

Оценку экспрессии гена фитохелатинсинтазы риса PCS1 проводили методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием пары красителей FAM/ROX и технологии межпраймерного переноса флуоресцентной резонансной энергии [Чемерис и др., 2005].

Статистическую обработку проводили с использованием программы Microsoft Excel 2003. Все опыты проводили не менее чем в трех биологических повторах и четырех-пяти аналитических повторностях, выборка составляла не менее 100 растений. В иллюстрациях и таблицах представлены средние арифметические значения и стандартные отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Цитологический анализ ростовых процессов при действии стифуна При применении стифуна выявлено возрастание митотической активности меристематических клеток апексов растений пшеницы (рис. 1). Во всех исследованных концентрациях наблюдалось увеличение длины закончивших рост клеток зоны растяжения корней. Существенное увеличение линейных размеров, сырой и сухой массы наблюдалось при дозах стифуна 0.033–330 мг/л, максимальный ростстимулирующий эффект – при 0.033 мг/л.

* * * * * * * * * * 2 1 2 3 4 5 6 А 1 2 3 4 5 6 Б Рис. 1. Митотический индекс (МИ) меристематических клеток проростков пшеницы через 48 ч от начала замачивания в растворах стифуна. А – корни, Б – побеги. 1 – контроль, стифун: 2 – 0.033 мг/л, 3 – 0.33 мг/л, 4 – 3.3 мг/л, 5 – 33 мг/л, 6 – 330 мг/л, – 3300 мг/л. * - статистически достоверные различия между контрольным и опытным вариантами (P<0.05) МИ, % МИ, % Влияние стифуна на баланс фитогормонов растений пшеницы Регуляция клеточного цикла и контроль элонгации клетки находятся под контролем фитогормонов [Swarup et al., 2002; del Pozo et al., 2005].

Концентрации индолилуксусной (ИУК) и абсцизовой кислот (АБК) при действии стифуна в побегах возрастали, в корнях наблюдалась тенденция возрастания ИУК, содержание АБК было меньше по сравнению с контролем (рис. 2).

Корни i PA Побег Дигидрозеатинрибозид ИУК Зеатинрибозид АБК 200 Дигидрозеатин зеатин iP Рис. 2. Изменение содержания фитогормонов АБК, ИУК и форм цитокининов в корнях и побегах пшеницы через 48 ч от начала замачивания в растворе стифуна (0.033 мг/л).

При действии стифуна в корнях увеличивались уровни изопентениладенозина (iPA), зеатина, зеатинрибозида, дигидрозеатинрибозида, в побегах возрастал уровень дигидрозеатинрибозида (рис. 2). Исследователи связывали возрастание МИ в корневых меристемах проростков гречихи с высоким содержанием уровня зеатина [Нефедьева, Хрянин, 2000]. По нашим данным повышение концентрации ЦК при действии стифуна сопровождалось 2-кратным возрастанием МИ в корнях (рис. 1А). Для ряда биологически активных соединений было показано, что их ростстимулирующее действие связано с изменениями преимущественно содержания ЦК [Безрукова и др., 2004;

Кильдибекова и др., 2004; Нургалиева и др., 2006]. Ранее при другом способе применения стифуна – предпосевной обработке семян, в корнях 12 сут растений пшеницы было выявлено возрастание общего уровня ЦК, ИУК, снижение содержания АБК [Яхин, 1999; Yakhin et al., 1998, 2000].

Pages:     || 2 | 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.