WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Таблица Выявление дефицитов C4A и C4B иммуноферментным анализом в микропанели и на блоте после изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле Номер C4A/C4B C4A/C4B Дефициты Дефициты сыворотки (микропанель) (блот) (микропанель) (блот) 1 0,89 0,90 – – 2 0,44 0,40 C4A C4A 3 0,36 0,39 C4A C4A 4 0,51 0,42 C4A C4A 5 0,93 0,97 – – 6 3,26 2,99 C4B C4B 7 1,90 2,17 C4B C4B 8 0,26 0,32 C4A C4A 9 2,01 4,64 C4B C4B 10 0,01 0,17 C4A C4A 11 1,56 1,97 C4B C4B 12 2,15 1,98 C4B C4B 13 2,88 2,72 C4B C4B 14 0,01 0,08 C4A C4A 15 0,27 0,24 C4A C4A 16 0,04 0,03 C4A C4A 17 0,28 0,30 C4A C4A 18 0,65 0,68 – – 19 1,70 3,19 C4B C4B 20 1,20 1,54 – – Установленные иммуноферментным анализом в микропанели и на блоте дефициты в сыворотках по варьированию отношения количеств или активностей C4A/C4B ( 0,5 или 2 в случае дефицита С4А или С4В, соответственно) полностью совпадали.

2.2. Изучение активности компонента С4 комплемента у беременных в I триместре гестации Для определения наличия дефицитов С4А и С4В изотипов компонента С4 комплемента у пациенток с различным течением беременности, было проведено определение относительной активности С4А, С4В и соотношение С4А/С4В у 12 здоровых беременных (контрольная группа) и у 30 беременных с невынашиванием в I триместре гестации (основная группа). Из них: у 18 беременных с начавшимся выкидышем, у которых беременность была сохранена (группа I); у 7 беременных с прервавшейся беременностью по типу самопроизвольного выкидыша (группа IIа) и у 5 беременных – с неразвивающейся беременностью (группа IIб).

Частота встречаемости врожденных дефицитов изотипов С4 компонента комплемента у обследованных беременных представлена в табл. 3.

Таблица Частота встречаемости врожденных дефицитов изотипов компонентов С4А и С4В комплемента в сыворотке крови у обследованных беременных Группы обследованных (n=42) Частота встречаемоОсновная группа (n=30) Контрольная сти дефицитов С4(%) группа Группа I Группа IIа Группа IIб (n=12) (n=18) (n=7) (n=5) Дефицит изотипа 11,0 0 20,0 25,С4А Дефицит изотипа 17,0 29,0* 80,0** 17,С4В Отсутствие де72,0 71,0 0 58,фицитов С Достоверные различия (р<0,05) * - между IIа и I, контрольной группой; ** - между IIб и I, IIа и контрольной группой.

В результате проведенного исследования выявлено, что у здоровых беременных частота встречаемости врожденных дефицитов изотипов компонентов составила для С4А-25 % и для С4В-17%, что соответствует нормальной частоте встречаемости дефи цитов изотипов C4. Изучение частоты встречаемости врожденных дефицитов С4А и С4В компонентов С4 комплемента у женщин с невынашиванием беременности показало, что в группе пациенток с прервавшейся беременностью, процент распределения женщин с врожденными дефицитами отличался от процента пациенток с нормально протекающей беременностью или от тех, у кого беременность была сохранена.

У всех женщин (в 100% случаев) с неразвивающейся беременностью имел место дефицит одного из изотипов компонента С4.

Изучение функциональной активности отдельных изотипов не выявило четкой закономерности дефицита С4А в различных группах беременных. Частота дефицитов С4А у здоровых беременных составляла 25%, у беременных группы I – 11%, группы IIб – 20% и не отмечена у беременных группы IIа. В то же время выявлены значительные различия в частоте встречаемости дефицита С4В комплемента у беременных с различным течением гестационного процесса. Так, в группе женщин с начавшимся выкидышем, но сохраненной беременностью (группа I) частота дефицита компонента С4В комплемента не отличалась от группы здоровых беременных (контрольная группа) и составляла 17%. В группе пациенток с наличием самопроизвольного выкидыша (группа IIа) дефицит изотипа С4В наблюдался почти в 2 раза чаще, чем в контроле и в группе I беременных, и составлял 29% (р<0,05). Наиболее выраженные изменения отмечены у женщин с неразвивающейся беременностью (группа IIб), у которых дефицит комплемента С4В достигал 80%, что достоверно выше (р<0,05), чем в других группах беременных.

Полученные результаты указывают на то, что СК человека выступает как сигнальная система, которая в условиях дефицита С4А или С4В (резкого преобладания одного изотипа по сравнению с другим изотипом) может приводить к патологическому протеканию беременности. Функциональное состояние изотипов С4 при этом выступает как лучший по сравнению с прочими компонентами СК индикатор неблагоприятного развития событий.

3. Дефициты С4А и С4В при антибактериальном и антитоксическом противодифтерийном иммунитете Удобной моделью для изучения влияния дефицитов изотипов С4 на иммунный ответ организма человека оказалось изучение иммунного ответа на Corynebacterium diphtheriae, поскольку этот возбудитель дифтерии в инфицированном организме вызывает двоякий иммунный ответ – образование антитоксических антител (в том числе против дифтерий ного токсина) и образование антибактериальных антител (против полисахаридов клеточной стенки C. diphtheriae). Мы предположили, что индивидуумы, имеющие врожденный дефицит C4A или C4B, должны по-разному вырабатывать антитоксический и антибактериальный иммунные ответы. Врожденные дефициты C4A и C4B в популяции достаточно высоки – составляют около 15% каждый, поэтому можно было ожидать существенных различий в иммунном ответе.

Было проведено исследование ингибирующего действия этих антигенов на формирование C3-конвертазы из C4A и C4B и установлено (раздел 1.2). Кроме того, у детей было проведено определение содержания антитоксических и антибактериальных антител и сравнено с частотой встречаемости врожденных дефицитов изотипов C4A и C4B. В сыворотках крови здоровых детей в возрасте менее 10 лет было проведено иммуноферментное определение в микропанели антибактериальных (против вакцины Кодивак) и антитоксических (против дифтерийного анатоксина) антител, а также количественных соотношений изотипов C4A и C4B компонента С4 комплемента, по которым выявляли наличие дефицитов. Диапазон средних концентраций специфических противодифтерийных иммуноглобулинов было принято считать типичным для популяции. Если у исследуемого индивидуума уровень специфических антител в сыворотке крови выходит за пределы диапазона в сторону уменьшения концентрации, это может свидетельствовать об их дефиците, и, как следствие, вероятности недостаточной специфической защиты. Наоборот, если показатели концентрации антител выходят за пределы диапазона в сторону увеличения концентрации, то можно говорить об избыточном их синтезе и аномальном состоянии иммунной системы. Широкий диапазон выявленных показателей противодифтерийных антител был разделен на 3 группы: с средним, высоким и низким уровнями антител. Результаты показаны в табл. 4.

Как было показано выше (раздел 1.2), существенные различия в связывании с C4A и C4B проявлял Кодивак, связываясь в 6,5 раз лучше с C4B, поэтому можно было ожидать влияние дефицитов C4B на антибактериальный иммунный ответ. С другой стороны, можно было ожидать, что дефицит C4A будет существенен для антитоксического иммунного ответа, поскольку Кодивак связывается хуже с C4A, чем анатоксин. Действительно, дефициты этих изотипов различным образом влияют на высокий иммунный ответ, как это показано на рис. 3, построенному по данным табл. 4.

Таблица Содержание антибактериальных и антитоксических антител и наличие дефицитов C4A и C4B в сыворотках крови здоровых детей Содержание Дефи- Соотно- №№ Содержание антител изотипов*, % цишение сыво- от контроля ты** роток Антибактериальные Антитоксические C4A C4B C4A/C4B 1 Среднее Высокое 130 264 0,49 C4A 2 Среднее Высокое 139 72 1,93 C4B 3 Среднее Низкое 98 175 0.56 Нет 4 Среднее Среднее 67 80 0,83 Нет 5 Среднее Среднее 64 142 0,45 C4A 6 Среднее Среднее 136 24 5,79 C4B 7 Среднее Среднее 53 47 1,13 Нет 8 Среднее Среднее 77 77 1,00 Нет 9 Среднее Среднее 172 12 14,40 C4B 10 Среднее Высокое 80 69 1,17 Нет 11 Среднее Среднее 142 35 4,10 C4B 12 Высокое Среднее 1 87 0,01 C4A 13 Высокое Среднее 1 23 0,04 C4A 14 Низкое Среднее 23 85 0,27 C4A 15 Высокое Среднее 13 46 0,29 C4A 16 Среднее Среднее 37 57 0,65 Нет 17 Низкое Среднее 41 23 1,80 С4В 18 Высокое Высокое 51 30 1,71 С4В 19 Низкое Низкое 24 20 1,18 Нет 20 Высокое Низкое 16 27 0,60 Нет 21 Низкое Среднее 22 10 2,30 C4B 22 Высокое Высокое 23 10 2,20 C4B Примечания. * Определение изотипов С4 в микропанели разработанным методом;

** дефицит изотипа подтвержден хемилюминесцентным анализом на блоте.

70% 60% 50% Д С4А 40% 30% Д С4В 20% 10% 0% АБ выс АТ выс Рис. 3. Содержание дефицитов C4A (Д С4А) и C4B (ДС4В) при высоких антибактериальном (АБ выс) и антитоксическом (АТ выс) ответах (p <0,05).

Приведенные выше результаты указывают на то, что высокий антибактериальный иммунный ответ наблюдается при относительно низком уровне дефицитов C4B, а высокий антитоксический ответ – при низком уровне дефицитов C4A.

ВЫВОДЫ 1. Разработан вариант иммуноферментного анализа функциональной активности изотипов С4А и С4В в микропанели, отличающийся от ранее применяемого тем, что используются антитела против С3 человека вместо антител против С4 человека. Метод позволяет выявлять дефициты С4А и С4В. На основе этого метода разработан способ определения констант ингибирования эффекторами связывания активированных С4А и С4В на мишени.

2. Разработаны варианты иммуноферментного анализа С4А и С4В на блоте, включающие их разделение изоэлектрофокусированием десиалированной сыворотки в полиакриламидном геле, электро- и иммуноблотинг и хемилюминесценцию пероксидазного коньюгата антител против С4 в режиме живого изображения. Определены интервалы варьирования изотипов С4А (рI 4,0–4,3) и С4В (4,58-4,65) человека.

3. Показано совпадение результатов по установлению дефицитов С4А или С4В в сыворотках человека методами, основанными на различиях в химической реакционной способности изотипов (иммуноферментный анализ в микропанели) и физико-химических свойств этих изотипов. и физико-химических свойств этих изотипов (иммуноферментный анализ на блоте).

4. Исследование наличия дефицитов изотипов компонента С4 комплемента может быть использовано в диагностике течения гестационного процесса и выделения групп повышенного риска женщин по невынашиванию беременности, особенно по типу неразвивающейся беременности.

5. Наличие дефицитов С4В в сыворотке крови может приводить к снижению уровня антибактериального иммунного ответа на Corynebacterium diphtheriae.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Лахтин В.М., Колесникова Е.В., Лахтин М.В., Козлов Л.В., Семенов В.А. (2004) Трехблотовый хемилюминесцентный анализ высокогликозилированных рекомбинантных и эндогенных форм эритропоэтина человека в режиме живого изображения с использованием изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле, двух блотингов и проявления моноклональными антителами-I, биотинилированными антителами-II и конъюгатом стрептавидина с пероксидазой хрена. В сб. Химия и биохимия углеводов: Материалы III всероссийской школы-конференции. Саратов: ООО «Ракурс», С.45.

2. Козлов Л.В., Лахтин М.В., Лахтин В.М., Максимова И.Д. (2005) Частота врожденных дефицитов компонентов комплемента С4А и С4В при язвах желудка, двенадцатиперстной кишки и гастродуоденитов. Гастроэнтерология (Санкт-Петербург), № 1-2. С. М61.

3. Алешкин В.А., Козлов Л.В., Савченко Т.Н., Новикова Л.И., Дондуп О.М., Лахтин М.В., Лахтин В.М., Протопопова Л.О. (2006) Врожденные дефициты изотипов Скомпонента комплемента при невынашивании беременности. В сб. Тезисы Международного конгресса "Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний". Москва, С.

4. Макаров О.В., Савченко Т.Н., Козлов Л.В., Новикова Л.И., Дондуп О.М., Точиева М.Х., Протопопова Л.О., Лахтин М.В., Лахтин В.М., Гора Н.В. (2006) Выявление врожденных дефицитов изотипов С4 компонента комплемента при нарушениях беременности и родов.

В сб. Тезисы VIII Российского форума "Мать и дитя". Москва, С.150.

5. Козлов Л.В, Лахтин М.В., Лахтин В.М., Макарова С.И., Шмелева Е.А. (2007) Влияние дефицитов изотипов С4А и С4В компонента С4 комплемента на характер иммунного ответа на Corynebacterium diphtheriae. В сб. Материалы IX съезда Всероссийского научнопрактического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Т.3. М.: Санэпидмедия. С.44-45.

6. Лахтин М.В., Козлов Л.В., Лахтин В.М., Дьяков В.Л. (2007) Выявление дефицитов изотипов C4A и C4B компонентов комплемента человека изоэлектрофокусированием и по различию в химической реакционной способности активированных форм. Биоорган. Химия, Т. 33; С.464-469.

Патенты 7. Козлов Л.В., Лахтин М.В., Лахтин В.М., Дьяков В.Л. (2005) Способ определения функциональной активности компонента С4 (изотип С4А) комплемента человека: Патент на изобретение № 2253118 (Россия). Б.И. № 15.

8. Козлов Л.В., Лахтин М.В., Лахтин В.М., Дьяков В.Л. (2005) Способ определения функциональной активности компонента С4 (изотип С4В) комплемента человека: Патент № 2253117 (Россия). Б.И. № 15.

Pages:     | 1 | 2 ||



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.