WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Калибровочные графики для определения функциональной активности C4A и C4B показаны на рис. 1. Результаты исследования стандартной (объединенной сыворотки от здоровых доноров), индивидуальных бездефицитных сывороток и сывороток с дефицитом С4А или С4В показали линейную положительную корреляцию между значениями оптической плотности поглощения субстрата и количеством C4 в лунках в микропанельном иммуноферментном анализе функциональной активности С4А или C4B.

Рис. 1. Зависимость оптической плотности поглощения субстрата от количества C4 в стандартной пулированной сыворотке, определенного иммуноферментным анализом функциональной активности C4А (левый график) и С4В (правый график).

1.2. Разработка новых вариантов микропанельного иммуноферментного анализа ингибирования изотипов С4А и С4В человека антигенами Ранее было исследовано ингибирование ковалентного связывания активированного фрагмента С4b компонента комплемента человека с его естественной мишенью – IgG человека. Поскольку ацилирование белковой мишени осуществляется преимущественно изотипом С4А, сравнение ингибирующего действия различных акцепторов проводилось в отношении активированного фрагмента С4Аb из изотипа С4А. Метод позволял сравнивать опсонизирующие свойства C4A в отношении преимущественно белковых антигенов.

Хотя при активации C4 происходило связывание и C4B с полисахаридным антигеном, это не мешало ковалентной сорбции C4A на мишени – IgG, которое и тестировалось в рамках иммуноферментного анализа.

Нами разработаны варианты микропанельного иммуноферментного анализа для оценки механизмов взаимодействия антигенов с С4А и С4В. Основой нового варианта ингибиторного иммуноферментного анализа являются разработанные варианты микропанельного иммуноферментного анализа С4А и С4В, описанные выше. Ингибирование обоих изотипов оценивали по изменению количества связанного с лунками микропанели С3b, проявляемого посредством антител против С3 человека. Об эффективности связывания C4b судили по активности образовавшейся C3-конвертазы (C4b2a), т.е. по количеству связавшегося на мишени C3b.

Для исследования взаимодействия акцепторов с C4A и C4B, в отдельности, был применен новый вариант метода определения активностей C4A и C4B по формированию C3-конвертазы, причем определение активности этих изотипов проводилось в присутствии акцепторов, взятых в различных концентрациях. Как и для аналогичной схемы, описанной ранее, ингибирование связывания C4b на микропанели при условии, когда концентрация акцептора [I] много выше концентрации компонента С4, описывается уравнением, аналогичным уравнению Михаэлиса-Ментен:

[I] =, Ki +[I ] где - доля связанного с ингибитором активированного C4b (процент ингибирования), - эффективность процесса ковалентного присоединения ингибитора к C4b (максимальный процент ингибирования), Ki – константа диссоциации обратимого комплекса акцептора (ингибитора) с C4b, [I] – концентрация ингибитора.

Были исследованы константы ингибирования дифтерийным анатоксином, используемым в качестве компонента поливакцин, и вакциной Кодивак (полисахаридной фракции клеточной стенки нетоксигенного штамма Corynebacterium diphtheriae) образования C3-конвертазы активированным C4b для изотипов C4A и C4B, то есть, равновесные константы диссоциации комплексов активированный C4b – ингибитор. Следует отметить, что эти же дифтерийные антигены используются при мониторинге противодифтерийного иммуноглобулинового ответа в организме человека. Данные приведены в табл. 1.

Таблица Константы ингибирования образования C3-конвертазы дифтерийным анатоксином и Кодиваком в экспериментах с участием C4A и C4B Ki, мкг/мл Антиген C4A C4B Анатоксин 105 ± 10 100 ± Кодивак 171 ± 29 26 ± Анатоксин/ Кодивак 0,6 3,Из табл. 1 видно, что константа ингибирования дифтерийным анатоксином одинакова для обоих изотипов компонента C4, в то время как Кодивак ингибирует активированный C4B в 6,5 раз лучше, чем C4A. В ингибировании C4A дифтерийный анатоксин почти в 2 раза предпочтительнее Кодивака, а в ингибировании C4B в 4 раза Кодивак предпочтительнее анатоксина. Следует отметить, что величина Ki для C4A и дифтерийного анатоксина практически совпала с аналогичной Ki (109 ± 47 мкг/мл), рассчитанной другим методом ранее. Полученные данные согласуются с представлениями о том, что C4A лучше связывается с белками, а C4B – с углеводами.

1.3. Разработка вариантов хемилюминесцентного анализа на блоте после изоэлектрофокусирования для визуального иммунохимического определения количеств изотипов С4А и С4В Иммуноферментный хемилюминесцентный анализ С4А и С4В на блоте является многоэтапным, включающим десиалирование сыворотки, ее изоэлектрофокусирование в геле, электроблотинг, иммуноблотинг и регистрацию хемилюминесценции. Были оптимизированы все этапы.

Как следует из литературных данных, изоэлектрофокусирование в полиакриламидном геле, использовалось, по-видимому, только однажды для определения С4А и С4В плазмы в сложном варианте проявления изотипов путем наслоения на ПААГ сенсибилизированных антителами эритроцитов барана с последующей регистрацией гемолиза. При этом не удалось избежать перекрывания областей С4А и С4В.

Известен один случай хемилюминесцентного анализа изотипов С4А и С4В, разделенных в агарозном геле и блотированных с последующим проявлением изотипов пероксидазными конъюгатами антител против антигенов Chido (для проявления С4В) и Rogers (для проявления С4А). В отличие от этих авторов мы использовали поликлональные антитела против С4 человека, которые доступнее моноклональных антител. Кроме того, по нашим данным в оптимизированных условиях проведения хемилюминесцентного анализа на блоте поликлональные антитела позволяют точно устанавливать дефицит изотипа, а также идентифицировать множественные формы изотипов (субизотипы). Нами также был использован субстрат BioWest, в 14 раз более чувствительный, чем субстрат ECL Plus, что повысило разрешающую способность метода при выявлении низких количеств изотипов и минорных субизотипов. Для снижения фона на блоте мы применили термообработку буфером при 50-55оС (активность иммобилизованной пероксидазы не снижается) и рН (4,24,5)-обработку (сохраняется связывание антител против С4) в режиме электроблотинга.

Десиалирование сывороток сиалидазой Clostridium perfringens используется для электрофоретического разделения С4А и С4В. Мы использовали десиалирование сывороточных С4А и С4В сиалидазой при 56оС в течение 30 мин (условиях термоденатурации комплемента). Это повысило эффективность десиалирования С4А и С4В.

Нами были разработаны варианты хемилюминесцентного анализа изотипирования компонента C4 комплемента человека. Процедура хемилюминесцентного анализа изотипов С4А и С4В сывороток включает отбор негемолизированных сывороток; обработку сиалидазой в присутствии этилендиаминтетрацетата натрия в течение ночи при комнатной температуре в темноте в условиях термоденатурации комплемента в первые 30 минут десиалирования; разделение асиалосыворотики изоэлектрофокусированием в градиенте рН 3-5 в полиакриламидном геле в присутствии мочевины и сахарозы; электроперенос белков из геля на иммобиллон-Р при рН 8.3; обработку полученного блота конъюгатом пероксидазы с антителами против С4 человека в течение ночи при 4оС; промывку блота в условиях термостатирования (50-55оС); проявление пероксидазы на блоте хемилюминесцентным субстратом с регистрацией картин возрастания, достижения максимума и спада хемилюминесценции С4А и С4В. Для улучшения фона и выраженности полос проводили обработку блота раствором уксусной кислоты с рН 4,2-4,5 в режиме электроблотинга. При этом антитела остаются связанными с блотом, а удаляются непрочно связанные слабо хемилюминесцирующие фоновые примеси между полосами субизотипов, между изотипами, а также между изотипами и положением электродов (рис. 2). Весь фон на блоте, обработанном бычьим сывороточным альбумином, становился однородным. Кроме того, при слабокислых рН анионы ацетата насыщают ацетат-связывающий субсайт в геме пероксидазы, располагающийся недалеко от субсайта связывания кислорода, что, по-видимому, приводит к уравниванию интенсивности хемилюминесценции пероксидазы в областях С4А и С4В. Полное удаление антител против С4 и полное отсутствие хемилюминесценции в областях С4А и С4В (на блоте-1) наблюдалось только в условиях электропереноса связанных с блотом антител против С4 при рН 2,9 (появление хемилюминесцирующих отпечатков на блоте-2, адекватно отражающих количественное превосходство одного из изотипов).

На рис. 2 показаны примеры разделения С4А и С4В на блоте после изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле для некоторых сывороток, приведенных далее в табл. 2. Видно, что хемилюминесцентный анализ позволяет разделять С4А и С4В с значительным запасом чистого пространства между изотипами на дисплее компьютера, между анодом и С4А и между катодом и С4В. Метод не только визуально выявляет дефицит одного из изотипов (подтверждается расчетом отношения С4А/С4В по данным количественного сканирования картины хемилюминесценции) при сравнении с стандартной сывороткой, но и дает оценку относительного содержания каждого из изотипов в наборе сывороток на едином блоте. Определены интервалы изоэлектрических точек областей сывороточных изотипов С4А (рI 4,0 – 4,3) и С4В (4,58-4,65), включающих наборы субизотипов.

Субизотипы характеризовали индивидуальные свойства сывороток и включали несколько изоформ, в том числе 1-2 мажорных. В зависимости от образца сыворотки, число субизотипов варьировало до 5 форм, что согласуется с данными литературы. Общее число различающихся по гемолитической активности субизотипов (аллотипов), исследованных в различных электрофоретических условиях, в популяции людей по данным литературы составляет несколько десятков.

Проведение хемилюминесцентного анализа 7 и более сывороток на едином блоте позволяет оценивать в сравниваемых сыворотках относительное содержание С4А или С4В и их мажорных субизотипов (рис. 2).

Индивидуальные свойства свечения в области С4А особенно разнообразны до обработки блота рН 4 (могут присутствовать дополнительные 1-2 минорные полосы). Помимо градиента рН 3-5, для анализа С4А могут быть использованы градиенты рН 4-6, 3-или их смесь. В качестве дополнительного контроля полученных результатов использовали электрофоретический полусухой перенос пероксидазного комплекса с полученного блота (блота-1) на блот-2 при рН 2,9. Анализ хемилюминесценции блота-2 подтвердил результаты установления дефицита изотипа С4А или С4В, полученные на блоте-1.

Анализ С4В упрощается после обработки блота при рН 4, а также при использовании низковольтного режима изоэлектрофокусирования в геле в течение ночи при 10оС.

Помимо градиента рН 3-5, для сравнительного анализа С4В сывороток может быть использован градиент рН 3-6. Получение блота-2 может улучшить выраженность области С4В.

С АНОД КАТОД 1 5 6 10 Рис. 2. Примеры хемилюминесценции областей С4А и С4В. Верхняя фотография – хемилюминесценция C4A и C4B семи асиалосывороток на едином блоте в период времени, когда минорные формы субизотипов уже не видны, но сохраняется хемилюминесценция мажорных форм субизотипов (стрелками показаны дефициты С4А или С4В; С – сыворотка сравнения с выраженными С4В и С4А). Нижняя фотография – типы хемилюминесценции изотипов С4А и С4В сывороток с полными наборами субизотипов (свечение инвертировано): бездефицитные сыворотки – 1, 5, с дефицитом С4А – 3, 10, или С4В – 6 (в случаях 3 и 10 по данным сканирования количеств С4А и С4В на блоте). Значения pH в геле определены на рН-метре; использованы также маркеры kit 2,5-6,5 (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция), термоденатурированный и мономерный БСА (показано стрелками) с рI 4,07 и рI 4,71, соответственно.

2. Определение дефицитов изотипов С4А и С4В разработанными вариантами микропанельного иммуноферментного анализа и хемилюминесцентного анализа на блоте в сыворотках пациентов и здоровых доноров Оценка дефицитов изотипов С4A и С4B компонента C4 комплемента человека основана на расчете отношения их количеств, определяемых микропанельным иммуноферментным анализом или хемилюминесцентным анализом.

2.1. Исследование дефицитов С4А и С4В в сыворотках пациентов Наличие нулевых аллелей с4аq0 и c4bq0 коррелирует с повышенной встречаемостью ряда аутоиммунных заболеваний. Повышенная частота встречаемости дефицитов C4A или C4B при ряде заболеваний была описана ранее в работах группы молекулярной иммунологии.

Высокая частота встречаемости нулевых аллелей говорит о распространенности того или иного дефицита C4 (в 15% для каждого – C4A или C4B) вплоть до 30% в популяции. Соотношение количеств (или активностей) C4A/C4B в норме (в 70% случаев) варьирует около 1, при монодефицитах С4А оно не превышает 0,50, а при монодефицитах С4В оно может превышать 2. При двойных дефицитах (в 2,25% для каждого) ожидаемые отношения примерно равны 0, 1 или более 2. Тройные дефициты еще менее вероятны – 0,3%, а полные – 0,05%. Из этих предварительных расчетов следует, что для обнаружения наиболее часто встречающихся врожденных дефицитов достаточно определять соотношение количеств (или активностей) C4A/C4B, а в том сомнительном случае, когда имеется двойной гетерогенный дефицит при соотношении около 1, оценивать общее снижение количества и активности C4.

С помощью разработанных вариантов иммуноферментного анализа было проведено сравнительное (в микропанели и на блоте) определение соотношений C4A/C4B в сыворотках больных с язвой желудка, язвой двенадцатиперстной кишки, гастродуоденитами. Результаты подтвердили полученные ранее данные о частоте дефицитов изотипов С4 в сыворотках больных с нарушениями в желудочно-кишечном тракте. Во всех 19 тестированных сыворотках пациентов с язвой желудка были выявлены дефициты только С4А.

Были исследованы также сыворотки больных с системной красной волчанкой, волчаночно подобными заболеваниями, ревматоидным артритом, васкулитами, антифосфолипидным синдромом, аллергическими отеками, содержащих в большинстве случаев врожденные дефициты изотипов C4.

В табл. 2 суммированы случаи выявленных дефицитов С4А или С4В в сыворотках указанных выше больных. Приведенные в табл. 2 данные свидетельствуют о соответствии результатов выявления дефицитов изотипов С4А и С4В, полученных новыми вариантами иммуноферментного анализа в микропанели и на блоте, а также о полезности комбинации обоих методов для установления дефицита изотипа в спорных случаях, когда соотношение С4А/С4В близко к значениям 0,5 или 2. Очень высокие значения отношения C4A/C4B (сыворотки 6 и 13) или низкие (сыворотки 10 и 14) могут означать гомозиготный дефицит C4B или C4A, соответственно.

Pages:     | 1 || 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.