WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

ЛАХТИН Михаил Владимирович ВАРИАНТЫ ИЗОТИПИРОВАНИЯ КОМПОНЕНТА С4 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2008

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Козлов Леонид Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Мазурова Изабелла Константиновна доктор биологических наук Суровцев Владимир Иванович

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится «»_2008 г. в часов на заседании специализированного совета Д 208.046.02 при ФГУН «Московский научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ по адресу: 125212 Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ.

Автореферат разослан апреля 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Л.И. Новикова 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Одним из направлений профилактической медицины является создание унифицированных современных тест-систем для клинических обследований гуморального статуса человека. В группе молекулярной иммунологии МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского разрабатываются иммуноферментные методы определения функциональной активности компонентов и факторов системы комплемента.

Ключевая роль компонента С4 состоит в его участии в начале каскада ферментативных реакций, осуществляемых системой комплемента после инициации классического пути, когда активацией С4 начинается формирование С3-конвертазы (С4b2a). Компонент С4 представлен изотипами С4А и С4В, которые кодируются двумя близко расположенными генами в коротком плече 6 хромосомы. В популяции нулевые аллели с4аq0 или c4bq0 встречаются с относительно высокой частотой (до 30%), что выражается в дефицитах С4А и С4В. Люди с выраженными дефицитами изотипов С4 подвержены риску заболеваний.

Структура изотипов С4А и С4В характеризуется наличием внутреннего тиолактонного кольца -CysGlyGluGlu-, функционирующего таким образом, что С4А преимущественно реагирует с белками, а С4В – углеводами. Различия функционирования С4А и С4В обусловлены тем, что в реакционном центре C4B в непосредственной близости к тиолактонному кольцу находится остаток His1106, замещенный на остаток Asp1106 в молекуле C4A. В результате в условиях раскрытия тиолактонного кольца С4А преимущественно взаимодействует с белками, а наличие His1106 создает условия для преимущественного взаимодействия С4В с углеводами.

Компонент С4 комплемента человека играет важную роль в иммунном ответе. Для иммунного ответа необходимо, чтобы антиген, опсонизированный комплементом, был опознан дендритными клетками, несущими на своей поверхности рецепторы комплемента. Опсонизация зависит от того, будет ли на первом этапе с антигеном ковалентно связываться С4. Дефицит С4А или С4В приводит к ухудшению иммунного ответа на белковый или углеводный антиген, соответственно. Врожденные дефициты С4А и С4В наблюдаются в случаях некоторых аутоиммунных болезней, бактериальных и вирусных инфекций.

Ранее в исследованиях группы молекулярной иммунологии были получены данные о роли врожденных дефицитов отдельных изотипов в предрасположенности к бактерионосительству (на примере хламидиоза), язве желудка, глаукоме.

Для обнаружения дефицитов был разработан метод иммуноферментного анализа, основанный на различиях в реакционной способности изотипов C4. Тем не менее возможно совершенствование метода с целью повышения его чувствительности и снижения себестоимости.

Цель исследования - разработка вариантов иммуноферментного анализа функциональной активности изотипов С4А и С4В, а также их количеств после изоэлектрофоретического разделения изотипов и применение разработанных методов в исследовании С4-изотипического статуса сывороток в норме и патологии.

Задачи исследования • разработать варианты иммуноферментного анализа функциональной активности С4А и С4В в микропанели; на их основе разработать микропанельные варианты иммуноферментного анализа для определения констант ингибирования акцепторами функционально активных С4А или С4В;

• разработать варианты иммуноферментного анализа, включающие изоэлектрофокусирование сывороток в полиакриламидном геле, электроблотинг, иммуноблотинг и хемилюминесценцию пероксидазной реакции в режиме живого изображения, для визуального определения С4А и С4В;

• апробировать разработанные варианты иммуноферментного анализа на сыворотках больных с дефицитами С4А и С4В;

• с помощью разработанных вариантов иммуноферментного анализа исследовать дефициты С4А и С4В в сыворотках крови людей, в том числе с нарушениями беременности и при иммунном ответе на Corynebacterium diphtheriae.

Научная новизна • разработаны высокочувствительные варианты иммуноферментного анализа функциональной активности изотипов С4А и С4В компонента С4 комплемента человека в микропанели и количественного хемилюминесцентного анализа изотипов С4А и С4В, позволяющие определять любые варианты дефицитов изотипов С4 в сыворотке, а также выявлять индивидуальные сывороточные особенности изотипов С4А и С4В;

• разработан высокочувствительный метод микропанельного иммуноферментного анализа ингибирования функциональной активности индивидуальных изотипов С4А и С4В сыворотки человека бактериальными антигенами;

• исследование наличия дефицитов изотипов компонента С4 комплемента может быть использовано в диагностике течения гестационного процесса и выделения групп повышенного риска женщин в невынашивании беременности, особенно по типу неразвивающейся беременности;

• наличие дефицитов С4В в сыворотке крови может приводить к снижению уровня антибактериального иммунного ответа на Corynebacterium diphtheriae.

Практическая значимость работы • Упрощена технология изотипирования компонента С4 комплемента в микропанели, предусматривающая использование более чувствительных и доступных реагентов – антител против С3 и пероксидазного конъюгата этих антител по сравнению с реагентами на основе С4 человека;

• метод позволяет определять дефицит С4А и С4В в сыворотке больных, что может быть расценено, как фактор риска развития аутоиммунных и инфекционных заболеваний и может быть рекомендован для широкого использования в клинических условиях для диагностики нарушений в иммунной системе вместе с другими клиническими показателями;

• практическая ценность работы подтверждена двумя патентами.

Положения, выносимые на защиту 1. Разработан вариант иммуноферментного анализа функциональной активности изотипов С4А и С4В в микропанели, отличающиеся тем, что используются антитела против С3 человека вместо антител против С4 человека.

2. Разработаны визуальные варианты одновременного количественного определения изотипов С4А и С4В, включающие разделение белков сыворотки изоэлектрофокусированием в полиакриламидном геле, электроблотинг, иммуноблотинг и хемилюминесценцию пероксидазы в режиме живого изображения.

3. Повышены возможности использования на практике метода определения компонента С4 комплемента человека для диагностики различных заболеваний.

Апробация материалов диссертации. Апробация проведена на совместном заседании секций «Медицинская биотехнология» и «Общая и прикладная иммунология» Ученого Совета ФГУН «МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского» Роспотребнадзора РФ, 14 апреля 2008 года, протокол № 3. Результаты докладывались на III всероссийской школеконференции «Химия и биохимия углеводов» (9-11 сентября 2004, Саратов), 7-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург – Гастро-2005»; май 2005, Санкт-Петербург; Международном конгрессе "Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний" (сентябрь 2006, Москва), VIII Российском форуме "Мать и дитя" (октябрь 2006, Москва), IX съезде Всероссийского научнопрактического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (26-27 апреля 2007, Москва).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, главы с обзором литературы на тему «Система комплемента человека», главы с описанием материалов, приборов и методов (включая собственные результаты), главы с изложением основных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы содержит 322 источника, в том числе 47 на русском языке. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 12 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Исследовали сыворотки людей следующих групп:

1. 22 здоровых детей в возрасте менее 10 лет (сыворотки предоставлены центром государственного санитарно-эпидемиологического надзора Западного Административного округа г. Москвы);

2. 12 беременных с нормальным течением беременности; 30 беременных с нарушениями течения беременности (сыворотки предоставлены кафедрой акушерства и гинекологии Московского Российского Государственного Медицинского Университета (зав. Кафедрой профессор О.В. Макаров);

3. 40 пациентов с язвой желудка, язвой двенадцатиперстной кишки, гастродуоденитами, ревматоидным артритом, васкулитами, антифосфолипидным синдромом, системной красной волчанкой, волчаночно подобными заболеваниями, аллергическими отеками (сыво ротки предоставлены КДЦ при ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ).

Использовали разработанные нами варианты иммуноферментного анализа изотипов С4А и С4В в сыворотке человека (описаны ниже в разделе 1 и главе 3 диссертации).

Для расчета количества белка в разведениях сыворотки применяли компьютерную программу для иммуноферментного анализа, разработанную ТОО «Микрофлора» при МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Достоверность различий между средними значениями исследованных показателей определялась с помощью компьютерных программ Statistica.

Для количественного анализа хемилюминесцентных картин использовали компьютерные программы LabWorks Version 4 (UVP, Calif., США).

Отдельные фрагменты работы выполняли совместно с Савченко Т.Н., Дондуп О.М.

и Гора Н.В. (клиническая характеристика групп пациенток с различным протеканием беременности и анализ изотипов С4 в сыворотках беременных новым методом), а также Шмелевой Е.А и Макаровой С.И. (определение противодифтерийных антибактериальных и антитоксических антител).

Результаты исследования и их обсуждение 1. Разработка вариантов иммуноферментного анализа изотипов С4А и С4В Одним из направлений профилактической медицины является создание современных тест-систем для клинических обследований населения. Нами разработаны варианты иммуноферментного анализа изотипов С4А и С4В в микропанели и на блоте после изоэлектрофокусирования.

1.1. Разработка микропанельных вариантов иммуноферментного анализа функциональной активности изотипов С4А и С4В Ранее были разработаны микропанельные варианты иммуноферментного анализа (ИФА) функциональной активности С4А и С4В, предусматривающие сорбцию в полистироловых лунках микропанели активаторов комплемента – IgG при определении C4A или липополисахарид (ЛПС) из клеточных стенок Salmonella typhi (препарата «Пирогенал») при определении C4B. В лунках микропанели активаторы инициировали каскад комплемента сыворотки при добавлении растворов, содержащих С4 в присутствии реагента R(сыворотки морской свинки или человека, не содержащей функционально активного С4, отсутствие которого на фоне избытка прочих компонентов комплемента делает зависимым развитие каскада от определяемого С4). В результате активации комплемента с активатором на поверхности лунок микропанели ковалентно связывается С4b (фрагмент С4 в виде изотипических фрагментов С4Аb и C4Bb), количество которого определяли с помощью пероксидазного конъюгата антител против С4 человека (аС4-П). Принцип определения функциональной активности изотипов С4А и С4В таков:

аС4-П С4А-ИФA: IgG IgG-C1- IgG-C1-[C4AbC2a]-C3b IgG-C1-C4AbC2a-C3b (исследуемая сыворотка+R4 морской свинки) С4В-ИФA: ЛПСЛПС-C1-ЛПС-C1-[C4ВbC2a]-C3bЛПС-C1-C4AbC2a-C3b аС4-П В новых вариантах иммуноферментного анализа функциональной активности изотипов С4А (вариант С4А-в-микропанели), С4В (вариант С4В-в-микропанели) в разных микропанелях использовали те же стадии, указанные выше, и R4 человека. Способ основан на способности функционально активного комплекса C4b2a (протеиназы – конвертазы С3) активировать С3 с образованием фрагмента C3b, который ковалентно связывается с активатором на поверхности лунок микропанели в непосредственной близости от С4b.

Количество С4b определяется путем измерения количества С3b. Тем самым достигается определение функциональной активности C4A или C4B иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации:

аС3-П С4А-ИФA: IgG IgG-C1- IgG-C1-[C4AbC2a]-C3b IgG-C1-C4AbC2a-C3b (исследуемая сыворотка+R4 человека) С4В-ИФA: ЛПСЛПС-C1-ЛПС-C1-[C4ВbC2a]-C3bЛПС-C1-C4AbC2a-C3b аС3-П Преимуществами новых вариантов микропанельного иммуноферментного анализа являются: а) увеличение чувствительности метода за счет амплификации процесса на стадии функционирования C3-конвертазы, б) использование для получения антител более стабильного выделяемого из сыворотки в большем (по сравнению с С4) количестве компонента комплемента – С3, в) возможность получения моноспецифических поликлональных антител против С3 в больших количествах и с более высокими рабочими разведениями по сравнению с антителами против С4 человека; г) доступность и низкая цена коммерческих антител против С3. Кроме того, эти варианты иммуноферментного анализа проще и быстрее других методов, например, иммуноферментного анализа на блоте после изоэлектрофокусирования в геле.

Длительность анализа 20 сывороток – до 5 часов (с использованием готовых сенсибилизированных пирогеналом или IgG микропанелей со сроком их хранения до 3 месяцев при –20оС).

Pages:     || 2 | 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.