WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Индукция двунитевых разрывов ДНК и репарация ДНК от них в делящихся лимфоцитах крови человека, облученных в адаптирующей дозе В настоящей главе представлены результаты исследований изменений чувствительности делящихся лимфоцитов крови человека, облученных в адаптирующей дозе, к образованию ДР ДНК тестирующим облучением в различное время после индукции адаптивного ответа. Было поставлено две основных задачи: а) изучить, приводит ли облучение делящихся лимфоцитов в адаптирующей дозе к активизации механизмов, снижающих количество индуцированных радиацией ДР ДНК или механизмов репарации ДНК от них; б) оценить, в течение какого времени после его индукции сохраняется АО. Для оценки изменений относительного количества ДР ДНК использовали метод ДНК-комет. Считается, что именно ДР ДНК отвечают за фрагментацию ДНК, определяемую методом ДНК-комет при проведении электрофореза при нейтральном рН (Calini et al., 2002). В наших предварительных исследованиях было показано, что значения момента хвоста ДНК-комет статистически достоверно (r>0.9, р<0.01) коррелируют с количеством фосфолирированного гистона Н2AX (-Н2AX), то есть с количеством распознанных ДР ДНК.

Полагают, что АО не является универсальным клеточным ответом на облучение в малых дозах, так как его проявление зависит от индивидуальных генетических особенностей организма, возраста и может быть модифицировано воздействиями, связанными с образом жизни, профессией, окружающей средой (Пелевина и др., 2007). Поэтому, для того, чтобы избежать неопределенности, связанной с индивидуальной вариабельностью проявления АО, в наших исследованиях использовалась кровь только от тех здоровых доноров, для лимфоцитов которых было ранее, с помощью стандартных цитогенетических тестов, показано наличие достоверного АО. Крайне важно было также выбрать оптимальную адаптирующую дозу и стадию клеточного цикла, на которой будет проведено облучение в этой дозе.

Анализ данных литературы и результатов собственных исследований показал, что хотя диапазон адаптирующих доз довольно широк (от 1 до 50 сГр), наиболее часто для индукции АО в лимфоцитах используют дозы 2-5 сГр (Пелевина и др., 2007;

Stoilov et al., 2007). С другой стороны, наиболее выраженный АО наблюдается, как правило, при облучении лимфоцитов через 20-24 ч после их стимуляции к делению, то есть в стадии G1 клеточного цикла (Пелевина и др., 2007; Stoilov et al., 2007). Основываясь на этих данных, для индукции АО мы выбрали адаптирующую дозу 5 сГр с облучением клеток через 24 ч после их стимуляции к делению ФГА.

Результаты наших исследований, представленные на рис. 1, свидетельствуют о том, что облучение культивируемых лимфоцитов в дозе 5 сГр через 24 ч после добавления ФГА приводит к статистически достоверному (р<0.05) снижению выхода ДР ДНК, индуцированных тестирующим облучением в дозе 10 Гр, через 24, 48 и 72 ч после адаптирующего облучения (48, 72 и 96 ч после стимуляции клеток к делению ФГА соответственно). Через 24 ч после адаптирующего облучения в облученных в малой дозе клетках относительное количество индуцированных тестирующим облучением ДР ДНК было меньше на ~ 24 % по сравнению с контролем.

Через 48 ч после адаптирующего облучения этот показатель увеличивается до ~ %, а через 72 ч опять снижается до ~ 29 %.

Проведенный в параллельных экспериментах анализ распределения делящихся лимфоцитов в 1-ом – 4-ом митозах через разное время после стимуляции ФГА показал, что пики 1-х митозов наблюдаются через 48 ч, 2-х – через 72 ч, 3-х – через 96 ч (Пелевина и др., 2008). По времени вступления в цикл и скорости движения по циклу популяция лимфоцитов неоднородна, что уже отмечалось и другими авторами (Wojcik et al., 1996).

Таким образом, полученные нами данные свидетельствует о том, что АО, связанный с уменьшением чувствительности ДНК клеток к образованию ДР, при последующем тестирующем облучении сохраняется в дочерних клетках, возникающих, по крайней мере, в течение 72 ч после его индукции (время ~ трех митозов). В пользу этого свидетельствует тот факт, что выраженность АО в наших экспериментах не уменьшается с увеличением времени после его инициации вплоть до 72 ч после облучения в адаптирующей дозе (96 ч после добавления ФГА).

Рис. 1. Показатель поврежденности ДНК, обусловленной ДР ее молекул (момент хвоста ДНК-комет, усл. ед.) в лимфоцитах крови человека (контрольных и подвергнутых адаптирующему воздействию -излучения в дозе 5 сГр через 24 ч после стимуляции к делению) непосредственно после тестирующего облучения в дозе 10 Гр, проводимого в различное время от момента стимуляции клеток к делению ФГА. * – различие эффекта тестирующего облучения в дозе 10 Гр в клетках, подвергавшихся адаптирующему облучению, от наблюдавшегося в контрольных клетках достоверно, p < 0.05.

Для изучения эффективности репарации ДНК от ДР в поколениях адаптированных и контрольных клеток, лимфоциты после тестирующего облучения в дозе 10 Гр инкубировали в течение одного часа. Согласно данным литературы, полученным с помощью метода ДНК-комет, за это время в лимфоцитах происходит репарация ДНК от ДР путем негомологичного воссоединения концов ее нитей в местах ДР (Wojewodzka et al., 2004). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что развитие АО в делящихся лимфоцитах в течение 24-72 ч после облучения в адаптирующей дозе (48-96 ч после добавления ФГА) не сопровождается статистически достоверным увеличением эффективности репарации ДНК от ДР путем негомологичного воссоединения концов ее нитей по местам ДР. Возможно, что инициация АО приводит в основном к активизации более медленной, но корректной репарации ДР ДНК путем гомологичной рекомбинации. Однако, проверить эту гипотезу в этих опытах на лимфоцитах крови пока не представляется возможным, так как через 4-6 ч после облучения в дозах, индуцирующих достаточное для анализа количество ДР ДНК, начинается апоптотическая межнуклеосомная деградация ДНК, то есть процесс глубокой фрагментации ДНК, мешающий анализу репарации ДНК от ДР.

Исследований изменений чувствительности по показателям индукции ДР ДНК и эффективности репарации ДНК от них к последующему облучению лимфоцитов крови, подвергнутых радиационному воздействию в адаптирующей дозе и стимулированных к делению ФГА, до настоящего времени никем не проводились.

Cramers et al. (2005), исследовавшие АО с помощью метода ДНК-комет, иммунофлуоресцентного анализа гистона -H2AX (специфичный маркер ДР ДНК) и метода принудительной конденсации хромосом в неделящихся лимфоцитах (cтадия G0), применяя облучение по схеме 5 (10) сГр + 2-8 Гр через 4 ч, показали, что в лимфоцитах, подвергнутых адаптирующему облучению, выход разрывов ДНК, индуцированных тестирующим облучением, достоверно ниже, чем в контроле. Причем эффективность репарации ДНК от разрывов достоверно не менялась. По всей видимости, основную роль в формировании АО по этому показателю в лимфоцитах играют процессы, предотвращающие образование радиоиндуцированных ДР ДНК (активизация систем антиоксидантной защиты, изменения конформации хроматина и т.д.), но не систем негомологичного воссоединения концов нитей ДНК по местам ДР.

Резюмируя вышеизложенное, мы можем сделать следующее заключение. Облучение в малой дозе делящихся лимфоцитов в стадии G1 индуцирует АО, проявляющийся в снижении чувствительности клеток к образованию ДР ДНК при тестирующем облучении. Индуцированный АО сохраняется, по крайней мере, в течение 72 ч (время ~ трех митозов). В формировании АО главную роль играет активизация клеточных систем, предотвращающих образование ДР в ДНК, но не активизация ее репарации от указанных разрывов путем негомологичного воссоединения концов нитей ДНК по местам разрывов.

2. Изменения поврежденности генома и чувствительности к образованию ДР ДНК при тестирующем облучении в поколениях облученных клеток линии СНО В главе представлены результаты исследования изменений поврежденности генома и чувствительности к образованию ДР ДНК при тестирующем облучении в поколениях культуры клеток яичника китайского хомяка линии СНО, облученных в дозе 1 Гр. Задача этих исследований состояла в том, чтобы выяснить закономерности изменений вышеупомянутых показателей в отдаленных потомках облученных клеток. Для оценки степени поврежденности генома, обусловленной ДР ДНК, использовали метод ДНК-комет при нейтральном рН.

Усредненные результаты исследования степени фрагментации ДНК клеток линии СНО в различное время после облучения в условиях нейтрального рН, позволяющих оценивать наблюдаемые изменения как результат возникновения ДР ДНК, представлены на рис.2. Как и ожидалось, непосредственно после облучения клеток в дозе 1 Гр отмечается увеличение фрагментированности ДНК, вызванной ДР ДНК, в 1.5-2.0 раза. Известно, что клетки линии СНО характеризуются периодом удвоения клеточной популяции 16-18 ч, поэтому уже через 2-е суток после облучения мы исследуем потомков облученных ранее клеток (ориентировочно второго поколения) и т.д. Результаты наших экспериментов показали, что через 4 суток (5-6 поколение) после облучения степень фрагментации ДНК потомков облученных клеток не отличалась от соответствующих контрольных значений (рис. 2).

Рис. 2. Изменения степени фрагментации ДНК, обусловленной образованием в ней ДР, наблюдавшиеся в клетках линии СНО в различное время после облучения в дозе 1 Гр. * - отличие от контроля достоверно, p <0.05; ** - отличие от контроля достоверно, p <0.01.

Однако, начиная с 7-х суток после облучения (9–10 поколение), регистрировалось статистически достоверное увеличение степени фрагментации ДНК de novo, что, по всей видимости, является проявлением радиационно-индуцированной нестабильности генома. Понятие «радиационно-индуцированная нестабильность генома» определяется как увеличение в потомстве облученных клеток частоты образующихся de novo генетических нарушений (мутации, хромосомные аберрации, дестабилизация хромосом, онкотрансформация и апоптоз) спонтанно, в отсутствие дополнительных радиационных воздействий (Seoane et al., 2007; Morgan et al., 2007). Основной особенностью генетической нестабильности такого рода является ее проявление на протяжении многих клеточных поколений после воздействия ионизирующего излучения без образования клеточных клонов с указанными выше нарушениями в геноме. В наших экспериментах повышение степени фрагментации ДНК регистрировалось вплоть до 21-х суток после облучения, с максимумом на и 18-е сутки (рис. 2). Обращает на себя внимание тот факт, что на 23-и и 28-е сутки после облучения степень фрагментации ДНК потомков облученных клеток снижалась и не отличалась от контроля (рис. 2).

По всей видимости, увеличение степени фрагментации ДНК, регистрируемое с помощью метода ДНК-комет, в этих опытах обусловлено преимущественно вкладом апоптотических клеток с высоко фрагментированной ДНК. Однако, не стоит забывать и о том факте, что в потомках облученных клеток при нестабильности генома наблюдается повышенный уровень активных форм кислорода (Кim et al., 2006), которые также вызывают различные повреждения ДНК, в том числе и двунитевые разрывы.

Наиболее интересные результаты были получены при исследовании изменений радиоповреждаемости ДНК потомков облученных клеток (рис. 3). Было показано, что на 7, 11, и 18-е сутки после облучения отмечается статистически достоверное увеличение чувствительности ДНК клеток к дополнительному (тестирующему) облучению в дозе 10 Гр, что, по всей видимости, обусловлено тем, что облучение накладывалось на эндогенную гиперпродукцию свободных радикалов и, возможно, на ситуацию истощения системы антиоксидантной защиты клеток от повреждений. Но на 23-е и 28-е сутки экспериментов наблюдался обратный эффект: устойчивость к дополнительному облучению возрастала.

В целом же, описанные здесь результаты исследования показали, что облучение клеток линии СНО в дозе 1 Гр проявляется в потомстве следующими эффектами: на 7-21-е сутки (9-31-е поколения) – увеличением поврежденности генома и чувствительности клеток к дополнительному облучению; на 23-28-е сутки (30-поколения) – возвращением поврежденности генома к контрольным значениям;

причем, в этих поколениях потомки облученных клеток становятся более устойчивыми к дополнительному облучению.

На основании анализа результатов исследования степени фрагментации ДНК, наблюдавшейся в клетках линии СНО в различное время после облучения в дозе 1 Гр и обусловленной образованием в ней ДР, можно высказать два предположения о причинах снижения ее выраженности в 30-34-м и 37-42-м пострадиационных поколениях клеток. Это может быть переход нестабильности генома в скрытое (латентное) состояние, либо это – завершение селекционного процесса элиминации клеток с нестабильным геномом, чувствительных к оксидативному стрессу.

Результаты изучения изменений чувствительности потомства облученных клеток к тестирующему облучения по тому же критерию указывают на вероятную реальность второго предположения.

Рис. 3. Изменения повреждаемости ДНК клеток линии СНО при повторном (тестирующем) облучении в дозе 10 Гр в различное время после облучения в дозе 1 Гр. Данные представлены как разница значений (инкремент) момента хвоста ДНК-комет после дополнительного облучения в дозе 10 Гр и значений момента хвоста ДНК-комет без дополнительного облучения. * - различия по отношению к контролю достоверны, p <0.05.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что нестабильность генома может создавать условия для функционирования селективного механизма, обеспечивающего формирование радиорезистентных клеточных клонов путем элиминации клеток с нестабильным геномом, чувствительных к оксидативному стрессу.

3. Изменения радиочувствительности ДНК лейкоцитов крови и клеток селезенки мышей в течение хронического облучения Задача этого раздела наших исследований состояла в том, чтобы выяснить закономерности изменени чувствительности ДНК к образованию ДР, индуцированных тестирующим облучением, в клеточных популяциях, подвергаемых длительному (в течение нескольких месяцев) постоянному низкоинтенсивному воздействию ионизирующего излучения in vivo. Для ее решения были поставлены опыты на мышах линии СВА/lac. Изменения поврежденности ДНК и ее чувствительности к индукции ДР тестирующим облучением в клетках системы крови хронически облучаемых и контрольных животных оценивали с помощью метода ДНК-комет при нейтральном рН.

Pages:     | 1 || 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.