WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

ЛИЗУНОВА Екатерина Юрьевна ИЗМЕНЕНИЯ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ В ПОКОЛЕНИЯХ ОБЛУЧЕННЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ 03.00.01- радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2009

Работа выполнена в лаборатории радиационной биофизики и экологии Учреждения Российской Академии Наук Института химической физики им.Н.Н. Семенова РАН

Научный консультант: доктор биологических наук Осипов Андреян Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Мазурик Виктор Константинович доктор биологических наук, профессор Сынзыныс Борис Иванович

Ведущая организация: ФГУ Российский Научный центр рентгенорадиологии Росмедтехнологий

Защита состоится «9» апреля 2009 г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д.501.001.65. в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, ГСП, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ по адресу: 119899, г. Москва, ГСП, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

Автореферат разослан « »_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.В.Веселова 2 Актуальность проблемы. Открытие таких эффектов воздействия ионизирующего излучения как снижение чувствительности к последующему облучению (адаптивный ответ) или повышение радиочувствительности (гиперчувствительность к облучению) заставило пересмотреть патофизиологические механизмы формирования отдалённых эффектов радиационного воздействия (Mothersill, Seymour, 2000; Пелевина и др., 2003). Предполагается, что облучение изменяет состояние клеточных защитных механизмов: систем антиоксидантной защиты, репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза (Пелевина и др., 2000; Серебряный и др., 2004). Многие исследователи считают, что механизмы изменения клеточной радиочувствительности тесно взаимосвязаны с механизмами индукции и реализации другого эффекта облучения - радиационно-индуцированной нестабильности генома (Пелевина и др., 2003; Okada et al., 2007; Schwartz et al., 2007: Seoane et al., 2007). Этот радиобиологический феномен проявляется в том, что часть клеток, выживших после облучения, может давать функционально измененное потомство, в котором с высокой частотой на протяжении многих поколений возникают de поvо аберрации хромосом и генные мутации, в ряде случаев приводящие к повышенной клеточной смертности путем апоптоза (Мазурик и Михайлов 2001, 2004). Как и всякое биологическое явление, нестабильность генома может иметь как негативное (амплификация генов, мутации, дестабилизация хромосом, неопластическая трансформация и др.), так и позитивное значение для биологической системы (формирование гипервариабельных участков паратопа антител, появление альтернативных путей адаптации к меняющимся условиям среды благодаря изменениям в геноме и т.д.). Известно, что физико-химические изменения молекул после действия ионизирующей радиации осуществляются в течение короткого промежутка времени, тогда как индуцируемые ими вышеописанные изменения могут быть обнаружены спустя длительное время после воздействия (дни, месяцы и, возможно, годы). Исследование молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе отдаленных эффектов облучения, является одной из ключевых и наиболее актуальных задач радиационной биологии.

В формировании эффектов облучения участвуют различные сигнальные пути, в которые вовлечены целый ряд белков, в частности, поли (АДФ-рибозо) полимераза, р53, протеинкиназа С (PКС), р38 митоген активирующая протеинкиназа (р38МАРК), фосфолипаза 1, кластерин и др. (Matsumoto et al., 2007). Однако, до сих пор нет единого мнения о том, в ответ на какие клеточные повреждения активируются системы клеточного отклика на облучение. Среди повреждений ДНК, вызываемых ионизирующим излучением, особое внимание исследователей привлекают двунитевые разрывы (ДР) ДНК. ДР, не устраненные в ходе репарации ДНК, приводят к цитогенетическим нарушениям и гибели клеток. Возможно, что именно ДР ДНК являются основным триггером, запускающим процессы клеточного отклика на воздействие ионизирующего излучения. Однако, исследования роли ДР ДНК в формировании отдаленных последствий облучения сравнительно немногочисленны. Неясно, за счет каких основных механизмов изменяется чувствительность потомков облученных клеток к тестирующему облучению: предотвращение образования ДР ДНК или активизация процессов репарации ДНК от них В течение скольких поколений облученных клеток сохраняется чувствительносить/резистентность к индукции ДР ДНК ионизирующим излучением и как она меняется Исходя из вышеизложенного, представлялось весьма актуальным изучить изменения степени поврежденности ДНК за счет ДР и чувствительности клеток к образованию ДР ДНК при дополнительном, тестирующем облучении в различных поколениях облученных клеток млекопитающих.

Цель и задачи исследования.

Цель работы состояла в изучении изменений клеточной радиочувствительности, оцененной по образованию ДР ДНК, индуцированных тестирующим (проявляющим) облучением, в поколениях остро и хронически облученных клеток млекопитающих. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- Исследовать изменения выхода и эффективности репарации ДНК от ДР, индуцированных тестирующим облучением в проявляющей дозе в адаптированных облучением в малой дозе и контрольных делящихся лимфоцитах в различное время после стимуляции клеток к делению.

- Оценить изменения степени поврежденности генома и радиочувствительности, оцененной по выходу ДР ДНК при тестирующем облучении, в 30-40 поколениях остро облученных клеток яичника китайского хомячка линии СНО.

- Изучить изменения выхода двунитевых разрывов ДНК, индуцированных облучением в проявляющей дозе, в клетках селезенки и крови мышей, подвергавшихся хроническому облучению, в зависимости от времени облучения и дозы.

Научная новизна. Впервые с помощью метода ДНК-комет были проведены исследования изменений чувствительности адаптированных облучением в малой дозе лимфоцитов периферической крови человека к индукции ДР ДНК облучением в тестирующей дозе, а также эффективности их репарации в течение 72 ч (время ~ трех митозов) после индукции адаптивного ответа. Впервые исследованы изменения степени поврежденности генома и чувствительности к дополнительному облучению в 37-42-х поколениях, облученных в дозе 1 Гр, клеток яичника китайского хомячка линии СНО. Получены новые результаты, свидетельствующие в пользу гипотезы о том, что нестабильность генома может создавать условия для активизации селективного механизма, приводящего к формированию радиорезистентных клеточных клонов. Впервые изучено влияние хронического радиационного воздействия на фрагментацию ДНК клеток крови и селезенки мышей, подвергавшихся в течение 40, 80 и 120 суток облучению с мощностью дозы 0.36 сГр/сутки. Впервые показано, что при хроническом воздействии -излучения на клетки млекопитающих, в зависимости от времени облучения и от накопленной дозы, реализуются различные системы защиты клеток от облучения, не связанные и связанные с изменением степени фрагментации ДНК в клеточной популяции.

Научно-практическая ценность работы. Результаты работы могут быть использованы в радиационной биологии при изучении механизмов возникновения и поддержания нестабильности генома, изменения радиочувствительности клеточных популяций в пострадиационном периоде, эффектов формирования отдаленных последствий облучения на клеточном уровне. Результаты исследований хронически облученных мышей будут весьма полезны при проведении радиоэкологического мониторинга окружающей среды, а в космической биологии и в медицине для оценки эффектов хронического облучения в малых дозах.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на V съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2006), Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2008) и 36-м ежегодном съезде Европейского общества по радиационным исследованиям (Tours, France, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, использованных в работе, 3-х глав результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит _ таблиц и рисунков. Список литературы включает источников, из них на иностранном языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Лимфоциты крови человека: выделение, условия культивирования и облучения. Выделение лимфоцитов из гепаринизированной крови человека проводили путем центрифугирования в градиенте плотности фикол-верографин («Histopaque», Sigma). После выделения лимфоциты отмывали и ресуспензировали в среде для культивирования клеток RPMI-1640 (фирма «Панэко», Россия) до конечной концентрации 1-2 x 106 клеток/мл.

Стимулированные к пролиферации фитогемоагглютинином (ФГА, 7 мкг/мл) лимфоциты культивировали в течение 24 – 96 ч в термостате при 37 °С в полной культуральной среде RPMI 1640 содержащей 20 % сыворотки крупного рогатого скота и антибиотики (все реактивы фирмы «Панэко», Россия).

Облучение клеток проводили на установке «Алтай» (Россия, источник -излучения 60Co) при мощности дозы 1 Гр/мин и температуре 4 C. Для определения непосредственной поврежденности ДНК в результате образования ДР, индуцированных проявляющим облучением в дозе 10 Гр, облучали агарозные слайды с иммобилизированными в них клетками. Этот методический подход позволяет сократить время между окончанием облучения и лизисом клеток до 30-60 сек.

Культура клеток: условия культивирования и облучения. В работе использовали культуру эпителиальных клеток яичников китайского хомячка (линия CHO). Время удвоения клеточной популяции - 16-18 ч.

Для культивирования клеток применяли стандартную полную среду DMEM, содержащую 10 % фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 1 % Lглютамина и антибиотики (пенициллин со стрептомицином). Выращивание клеток проводили в стандартном CO2-инкубаторе при 37 °C в атмосфере с 5 % содержанием CO2. Пересев клеток проводили каждые 2-3 суток в фазе экспоненциального роста.

Клетки подвергали воздействию -излучения 60Co в дозах 1 Гр и 10 Гр (в зависимости от условий эксперимента) при мощности поглощенной дозы 1 Гр/мин (облучательная установка«Алтай», Россия).

Экспериментальные животные: облучение, отбор биоматериала. Эксперименты проводили на мышах-самцах линии СВА/lac исходной массой 14–16 г, полученных из питомника «Столбовая» РАМН (Московская обл.) В течение эксперимента мышей содержали на стандартном рационе вивария (сухой гранулированный корм и вода ad libitum). Состав рациона не менялся. Распределение животных на группы проводили путем случайной выборки.

Мыши подвергались воздействию -излучения 137Сs круглосуточно в течение 40, 80 и 120 суток при мощности поглощенной дозы 0,36 сГр/сут. Суммарная поглощенная доза, полученная животными, составила 14,4, 28,8 и 43,2 сГр соответственно.

Животных умерщвляли путем цервикальной дислокации. Периферическую кровь отбирали в пробирки с гепарином (20 МЕ на 1 мл крови). Селезенку гомогенизировали в охлажденном до 4 С фосфатно-солевым буфере (137 ммоль/л NaCl, 2.7 ммоль/л KCl, 10 ммоль/л Na2HPO4, 2 ммоль/л K2HPO4, рН 7.4) (1 мл буфера на 10 мг ткани лимфоидного органа). Суспензию клеток фильтровали через нейлоновую сетку. Концентрацию клеток определяли в камере Горяева с помощью микроскопа типа SK-14 фирмы "PZO" (Польша). Суспензию лимфоцитов (20 мкл) смешивали со 100 мкл 0.5 % раствора легкоплавкой агарозы (тип IV) в фосфатносолевом буфере (рН 7,4) при температуре 37 С и наносили на предварительно покрытые слоем 1 % нормоплавкой агарозы предметные стекла, накрывали покровными стеклами и выдерживали 5 мин при 4 С на предварительно охлажденной металлической пластине. После солидификации агарозы удаляли покровные стекла и полученные сайды помещали в охлажденный (4 С) боратный буфер.

Облучение иммобилизированных в агарозу клеток проводили в боратном буфере при 4 С на -установке 60Co «Луч» («Изотоп», Россия) в дозе 4 Гр при мощности дозы 0.35 сГр/мин. Контрольные препараты выдерживали в течение времени облучения в боратном буфере при 4С.

Оценка фрагментированности ДНК, обусловленной образованием ДР.

Фрагментированность ДНК под влиянием ДР в клетках непосредственно (через 3060 с, 4 C) и через 1 ч после облучения (1-часовая инкубация клеток при 37 С в полной культуральной среде RPMI 1640) определяли модифицированным методом электрофореза ДНК единичных клеток (метод ДНК-комет) при нейтральном значении рН (основные условия электрофореза: 1 В/см, 4 С, 20 мин) (Воробьева и др.

2007). Степень фрагментированности ДНК, определяемая этим методом, оценивается после проведения электрофореза ДНК единичных клеток, иммобилизованных в агарозу, по количеству двунитевой ДНК, мигрировавшей из ядерной области, и расстоянию ее миграции из «ядра» ДНК-кометы» в «хвост».

Для окраски ДНК использовали акридиновый оранжевый («Sigma», США) (2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, рН 7.4). Визуализацию ДНК-комет проводили с помощью микроскопа «Люмам P-8» («ЛОМО», Россия) с использованием системы визуализации микрофотоизображений «Микмед-1600-3ф» («ОМО», Россия). ДНК-кометы клеток в каждой пробе подвергали анализу, используя программу СometScore v. 1.5 (TriTek Corp. http://tritekcorp.com). Программа оценивает момент хвоста ДНК-комет в усл. ед. (момент хвоста по Оливе) равный произведению расстояния от центра «ядра» до центра плотности ДНК «хвоста» ДНК-кометы в пикселях на % ДНК в «хвосте». Вычисляли среднее арифметическое момента хвоста 100 ДНК-комет для пробы и варианты значений показателя по каждой пробе включали в сводную выборку по всем пробам для последующей статистической обработки.

Статистический анализ полученных данных. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 6.0. Результаты исследований представлены как среднее арифметическое ± стандартная ошибка. Для оценки различий использовали t-критерий Стьюдента.

Pages:     || 2 | 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.