WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Также было исследовано взаимовлияние двух молекул ZrvIIB на процесс связывания с поверхностью модельной мембраны прокариот. В начальной конформации пептиды располагались параллельно друг другу на расстоянии 2,4 нм между центрами масс. Расстояние между молекулами зервамицина IIB сократилось за первые 6 нс с 2,4 нм до 1 нм. При этом молекулы образовали димер. В димере пептиды расположены параллельно друг другу. Две молекулы зервамицина IIB взаимодействуют гидрофобными областями, изолируя тем самым неполярные аминокислотные остатки от молекул воды и полярных головок липидов. Предположительно, образование такого димера должно облегчить прохождение молекул через область липидных головок. Как видно из Рис. 4, взаимодействие молекул зервамицина IIB в данном эксперименте с мембраной сильнее, чем в случае одиночной молекулы. Обе молекулы приблизились N-концами к липидам и расположены под углом ~ 20° к поверхности мембраны. N-конец основной цепи одной молекулы димера входит в область липидных голов ниже плоскости атомов фосфора. У второй молекулы основная цепь находится в водном окружении, но боковые радикалы 4-рех аминокислотных остатков находятся в области липидных голов. Вероятно, для дальнейшего встраивания в мембрану димер должен претерпеть конформационные изменения, чтобы гидрофобные аминокислотные остатки оказались снаружи и могли взаимодействовать с гидрофобными хвостами жирных кислот.

А Б Рис. 4 Положение C-атомов относительно атомов фосфора липидных головок бислоя в начальной конформацим и после 10нс равновесной динамики отдельно для каждой молекулы (А, Б).

При взаимодействии с липидными головками молекулы зервамицина IIB образуют порядка 8 водородных связей. Молекула, которая глубже проникла в липидный бислой образует 3 водородные связи с участием боковых радикалов остатков Gln3 и Thr6. Второй пептид образует 5 связей с участием Ace0, Gln3, Thr6 и Gln11. Первая молекула, проникая в область липидных головок, стерически расталкивает молекулы липидов, тем самым, удаляя потенциальных доноров и акцепторов водородных связей.

При взаимоперпендикулярном расположении двух молекул ZrvIIB на поверхности мембраны ПОФЭ/ПОФГ, через 16 нс наметилась тенденция к образованию комплекса. Таким образом, при высокой концентрации молекулы зервамицина IIB образуют димеры, однако при произвольном начальном положении пептидов на это требуется достаточно большое время, и не смотря на то, что этот процесс облегчает взаимодействие пептидов с мембраной, он не является обязательным.

Для исследования динамики встраивания зервамицина в модельные мембраны прокариот и эукариот с помощью метода управляемой молекулярной динамики был проведен ряд численных экспериментов, в которых внешняя сила прикладывалась отдельно к С и N-концам и к Сатомам. В качестве начальной структуры использовались системы, состоящие из липидного бислоя и молекулы зервамицина IIB после 10нс релаксации на поверхности мембраны.

В обеих исследуемых системах (с липидными бислоями ПОФХ и ПОФЭ/ПОФГ) под действием силы 4,3 ккал/(моль·), приложенной к Сконцу ZrvIIB в течение 10нс развернулся С-концом к мембране, но не углубился в область гидрофобных хвостов. Вероятно, это связано с торможением за счет образования водородных связей между остатками Hyp10, Gln11, Hyp13, Phl16 и липидными головками. В эксперименте, где сила 0,27 ккал/(моль·) была приложена ко всем С-атомам пептида, ZrvIIB в течение 10 нс оставался в области липидных головок параллельно поверхности бислоя. Когда сила была приложена к N-концу, пептид за 10 нс вошел в область липидных головок, не вызвав при этом структурных изменений в липидном бислое. Таким образом, данные численные эксперименты подтверждают гипотезу, что встраивание в мембрану происходит N-концом. Так как приложение силы ко всем С-атомам не привело к встраиванию пептида, можно сделать вывод, что воздействие на пептид, переводящее его из поверхностного состояния в трансмембранное, в основном направлено на N-конец молекулы, что хорошо согласуется с моделью потенциал-зависимой активации канала, согласно которой трансмембранный потенциал разворачивает дипольный момент молекулы, то есть «тянет» несущий локальный положительный заряд N-конца внутрь мембраны.

На следующем этапе работы более детально был исследован процесс встраивания молекулы зервамицина IIB в липидные бислои. Для этого были рассчитаны три траектории, в которых к N-концу (к C-атому остатка ACE0) были приложены силы, равные 4,3; 5,7 и 8,6 ккал/(моль·) соответственно, с целью определить оптимальное значение силы для моделирования встраивания. При ускорении эквивалентном 4,3 ккал/(моль·) встраивание происходит медленно, и за 10 нс N-конец преодолевает только верхний монослой. Под действием 5,7 ккал/(моль·) ZrvIIB полностью встраивается за 7 нс и остается в трансмембранной положении. При значении силы 8,ккал/(моль·) пептид проходит сквозь мембрану и выходит в водное окружение, не испытывая значительного торможения от энергетических барьеров. Таким образом, для изучения динамики встраивания ZrvIIB в липидный бислой было выбрано использовать значение внешней силы 5,(ккал/моль·).

Рис. 5 Изменение z-координаты N-конца зервамицина IIB относительно границы мембраны ПОФХ под действием внешней силы Динамика встраивания ZrvIIB в липидный бислой ПОФХ происходит неравномерно. Можно выделить три стадии. В начале N-конец движется в водном окружении, приближаясь к липидным головкам. На первой стадии аминокислотные остатки Ace0-Tpr1-Ile2 входят в гидрофобную область мембраны. Далее Gln3 и Thr6 образуют водородные связи с полярными головками липидов и тем самым замедляют дальнейшее встраивание пептида. На второй стадии в гидрофобную область входят остатки Gln3Dva4-Ile5-Thr6-Aib7-Leu8-Aib9, а Hyp10 и Gln11 взаимодействуют с полярной областью мембраны и вызывают замедление динамики встраивания. На третьей (заключительной) стадии весь пептид встраивается в липидный бислой.

А Б Рис. 6 Кулоновская, ван-дер-ваальсовская энергии взаимодействия и их сумма (энергия взаимодействия) для молекулы зервамицина IIB с липидами ПОФХ (А) и водой (Б) При встраивании молекулы ZrvIIB в липидный бислой энергия взаимодействия пептида с липидами, рассчитанная как сумма кулоновских и ван-дер-ваальсовских взаимодействий, уменьшилась на величину ~кДж/моль (Рис. 6). А энергия взаимодействия пептида с водой возросла примерно на 800 кДж/моль. Как видно из графиков, основной составляющей энергии взаимодействия пептида с водой является кулоновское взаимодействие, а пептида с липидами – ван-дер-ваальсовское. Однако в сумме они дают примерно одинаковые вклады в изменение энергии при встраивании. Таким образом, потенциальная энергия взаимодействия зервамицина IIB с окружением при встраивании в липидный бислой практически не изменяется. На графике зависимости энергии взаимодействия от времени видно изменение энергии на каждой стадии процесса встраивания. Так на первой стадии энергия падает приблизительно на кДж/моль, на второй стадии на ~370 кДж/моль, а на третьей - на ~кДж/моль. Изменение энергии на каждой стадии пропорционально количеству аминокислотных остатков, вошедших в липидный бислой на данной стадии.

При встраивании ZrvIIB в липидный бислой ПОФЭ/ПОФГ динамика движения N-конца пептида более линейна и стадийность не так ярко выражена. На первой стадии ZrvIIB погружается в липидный бислой до Gln3, который, образуя водородные связи с липидными головками, удерживает пептид на поверхности. При этом пептид ориентируется перпендикулярно поверхности мембраны, так как сила дополнительно разворачивает пептид вдоль действия поля. В случае с ПОФХ мембраны из липидов такой сильный разворот не наблюдался. Это может быть объяснено отталкиванием отрицательно заряженного С-конца от поверхности мембраны. Дальнейшее продвижение пептида вызывает деформацию мембраны и изгиб спирали пептида за счет сильного взаимодействия положительного N-конца с отрицательно заряженной поверхностью мембраны. Липидные головки, находящиеся рядом с пептидом, двигаются вместе с ним в гидрофобную область мембраны. Через 7 нс Hyp10 образует водородные связи с липидными головками и частично разворачивает пептид к поверхности бислоя. В течение следующих 2-х нс разрываются водородные связи между Gln3 и липидными головками, и структура бислоя нормализуется. Пептид встраивается до Hyp10, который вместе с Gln11 взаимодействует с липидными головками. Последующие 5 нс продвижение N-конца в гидрофобную область мембраны вызывается распрямлением спирали пептида. Все это время Hyp10 и Gln11 находятся в области липидных головок. На последней стадии Hyp10 и Gln11 разрывают водородные связи с полярными головками и пептид полностью встраивается в липидный бислой.

А Б Рис. 7 Кулоновская, Ван-дер-Ваальсова энергии взаимодействия и их сумма (энергия взаимодействия) для молекулы зервамицина IIB с липидами ПОФЭ/ПОФГ (А) и водой (Б) На Рис. 7 видно, что энергия взаимодействия пептида с липидами при встраивании уменьшилась на величину порядка 600 кДж/моль, а энергия взаимодействия с молекулами воды увеличилась приблизительно на кДж/моль. Следовательно, в процессе встраивания потенциальная энергия взаимодействия пептида с окружением уменьшается на 200 кДж/моль.

Потенциальная энергия трансмембранного состояния в случае с мембраной ПОФЭ/ПОФГ меньше, чем для пептида, связанного с поверхностью бислоя.

Однако, при одинаковой внешней силе времени на встраивание пептида в ПОФЭ/ПОФГ мембрану требуется больше, чем в случае с мембраной ПОФХ, что свидетельствует о том, что пептиду необходимо преодолеть более высокий энергетический барьер. При сравнении Рис. 6А и Рис. 7А видно, что во втором случае минимумы кулоновской энергии более выражены, что свидетельствует о более сильном взаимодействии полярных остатков с липидными головками. На суммарной энергии взаимодействия также видны энергетические барьеры, соответствующие образованию водородных связей остатков Gln3, Hyp10, Gln11 с липидными головками.

Потенциальная энергия взаимодействия ZrvIIB с окружением при встраивании в мембрану ПОФХ не изменяется, а при встраивании в мембрану ПОФЭ/ПОФГ уменьшается на 200 кДж/моль, однако пептиду надо преодолеть более высокий энергетический барьер из-за более сильного взаимодействия пептида с головками липидов ПОФЭ и ПОФГ.

В пятой главе исследовалась динамика трех моделей зервамицинового канала, состоящего из 4 (N4), 5 (N5) и 6 (N6) молекул ZrvIIB, в мембране ПОФЭ/ПОФГ, а также миграция иона Na+ через пору канала, образованного пятью молекулами ZrvIIB. Начальные структуры каналов собирались так, чтобы пептиды были расположены параллельно друг другу, и остаток Glnбыл обращен в пору канала.

Конформационная стабильность молекул ZrvIIB в каналах была оценена с помощью среднеквадратичного отклонения (RMSD) относительно начального положения С-атомов пептидов. За 2 нс RMSD для тетрамера выросло до 0,27 нм, в то время как RMSD для N5 и N6 каналов составило 0,17 нм и 0,16 нм соответственно.

В начальной конформации каналов молекулы ZrvIIB были параллельны оси канала, после 10 нс в N5 канале пептиды повернулись под небольшим углом к его оси и сформировали суперспираль (Рис. 8А). В N6 канале молекулы ZrvIIB остались параллельно оси канала (Рис. 8Б). Вероятно, что формирование суперспирали стабилизирует канал и увеличивает время жизни. Предположительно, не только пентамер способен формировать суперспираль, но и каналы, состоящие из большего количества субъединиц.

Но на такой процесс требуется больше времения, так как в согласованном повороте участвует большее количество молекул.

А Б Рис. 8 Положение молекул зервамицина IIB в канале N5 (А - вид сбоку, Б - вид сверху) и в канале N6 (В - вид сбоку, Г - вид сверху). Прямыми и стрелками указаны направления молекул пептидов от N-конца к С-концу.

Большее по сравнению с N5 и N6 каналами значение RMSD для тетрамера обусловлено отсутствием непрерывного ряда молекул воды в полости канала. Так как водородные связи, образованные молекулами воды в поре и гидрофильными аминокислотными остатками, стабилизируют положение пептидов в связке относительно другу друга. В случае каналов Nи N6 непрерывная колонна молекул воды хорошо выражена (Рис. 9Б, В). В узких областях N5 канала количество молекул воды недостаточно для формирования гидратной «шубы» проводимых ионов. На данных участках, вероятнее всего роль молекул воды гидратной оболочки выполняют атомы кислорода полярных остатков. В полости канала N6 молекул воды достаточно, чтобы проводимые ионы могли двигаться сквозь него, не нарушая целостность гидратной оболочки.

А Б В Рис. 9 Положение молекул воды в поре каналов N4 (А), N5 (Б) и N6 (В). Красным выделена область молекулы зервамицина, утратившая начальную спиральную структуру.

С помощью программы HOLE были получены профили радиусов для исследуемых каналов (Рис. 10). N4 канал имеет радиус поры ~0,2, что слишком мало для прохождения иона. Поскольку N4 не имеет выраженной колонны молекул воды в поре и радиус канала слишком мал, предположительно, тетрамер не формирует проводящий ионный канал, а является «предшественником» каналов из большего количества субъединиц.

N5 и N6 каналы после 10 нс релаксации имеют по две области с минимальным радиусом (2.7 и 2.5 у N5; 3.8 и 3.7 у N6) обе эти области сформированы глутаминовыми кольцами (Gln3 и Gln11).

Согласно теоретическим представлениям о структуре зервамициновых каналов, молекулы пептидов должны быть обращены полярной (выпуклой) стороной в полость канала, а гидрофобной (вогнутой) в область гидрофобных хвостов. В пентамере все полярные аминокислотные остатки обращены в полость канала или к соседним пептидам. К липидным хвостам направлены только боковые радикалы гидрофобных аминокислотных остатков. В случае гескамера два полярных аминокислотных остатка (Thr6 и Hyp13) обращены в гидрофобную часть мембраны.

Рис. 10 Профили радиусов для каналов N4, N5 и N6 после релаксации.

Для исследования прохождения иона был выбран канал N5. Выбор обусловлен тем, что тетрамер не формирует проводящий канал, а радиус поры N6 канала достаточно большой и внутренний «интерьер» канала не сильно влияет на движение иона. Исследования проводились с помощью метода управляемой молекулярной динамики. К иону Na+ прикладывалась внешняя сила равная 4.38 ккал/(моль·). Ион под ее действием двигался от С-концов к N-концам пептидов.

А Б Рис. 11 А. Изменение z коодинаты (вдоль оси канала) иона Na+ от времени. Б. Зависимость энергия взаимодействия иона Na+ с молекулами зервамицина и воды от z-координаты.

Pages:     | 1 || 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.