WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Левцова Ольга Владимировна ДИНАМИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ С БИОМЕМБРАНАМИ Специальность: 03.00.02. – “Биофизика”

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2008

Работа выполнена на кафедре биоинженерии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный консультант: доктор физико-математических наук, профессор Шайтан Константин Вольдемарович Официальные доктор физико-математических наук оппоненты: Крупянский Юрий Федорович доктор химический наук Немухин Александр Владимирович

Ведущая организация: Институт математических проблем биологии РАН, г. Пущино

Защита состоится “ ” ноября 2008 г. в : на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория “новая”.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан: “ ” октября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Т.Е. Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время наблюдается рост устойчивости инфекционных заболеваний к применяемым в медицине антимикробным препаратам. В этой связи все большее внимание привлекают мембранактивные антимикробные пептиды, к которым не возникает резистентность микроорганизмов. Изучение механизма действия и выявление закономерностей между первичной последовательностью, структурой и функциональной активностью мембранактивных антимикробных пептидов началось относительно недавно. До сих пор ведутся дискуссии по целому ряду фундаментальных вопросов формирования структуры пептидмембранных комплексов. В связи с этим изучение методами полноатомного молекулярного моделирования взаимодействия мембран активных пептидов с биомембранами является актуальным как с фундаментальной, так и с прикладной точек зрения. В перспективе эти исследования позволят конструировать принципиально новые мембранактивные агенты с заданной активностью и специфичностью.

Цель исследования. Объектом исследования данной работы является зервамицин IIB (ZrvIIB) – представитель класса пептаиболов, продуцируемый грибом Emericellopsis salmosynnemata, который проявляет каналообразующую активность. Целью настоящей работы было исследование динамики и механизма действия ZrvIIB на атомном уровне методами равновесной и управляемой молекулярной динамики.

Основные задачи исследования.

Определение с помощью полноатомых моделей 1. Стабильности спиральной структуры зервамицина IIB в воде и в метаноле.

2. Влияния точечных аминокислотных замен на изменение амплитуды шарнирных движений, изгибающих спираль по сравнению с длинными пептаиболами.

3. Сравнение связывания молекулы зервамицина IIB с поверхностью модельных мембран эукариот, состоящих из пальмитоилолеоилфосфатидилхолиновых (ПОФХ) липидов, и мембран прокариот, состоящих из молекул пальмитотлолеоилфосфатидилэтаноламиновых (ПОФЭ) и пальмитоилолеоилфосфатидилглицероловых (ПОФГ) липидов в соотношении 4:1 соответственно, под действием внешнего электрического поля.

4. Оценка взаимовлияния молекул зервамицина IIB на связывание с модельной мембраной прокариот.

5. Изучение динамики встраивания молекул зервамицина IIB в мембрану и оценка эффектов агрегации 4, 5 и 6 молекул зервамицина IIB с образованием проводящего канала в модельной мембране прокариот.

Научная новизна и практическая значимость работы. В данной диссертационной работе впервые:

1. методом МД показана стабильность спиральной структуры в воде, в метаноле и на поверхности мембраны.

2. исследованы шарнирные движения ряда мутантов и определена последовательность аминокислотных остатков, отвечающая за изменение их амплитуды в растворителях различной полярности.

3. показана склонность молекул зервамицина IIB к димеризации на поверхности мембраны 4. определена динамика встраивания молекулы зервамицина IIB в мембрану 5. предложены модели каналов, состоящие из 4, 5 и 6 молекул зервамицина IIB Полученные данные позволили предложить детальную модель механизма действия зервамицина IIB и определить функциональную роль отдельных остатков.

Достоверность результатов диссертации обеспечивается использованием универсальных законов и уравнений классической и квантовой механики и проведением тестовых расчетов систем, сравнимых с экспериментальными данными Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на международной конференции «Ломоносов-2005» (Москва 2005 г.), на третьем съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2005 г.), на международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Звенигород, 2005 г.), на пятой международной конференции по биоинформатике и геномной регуляции и структуре (Новосибирск, 2006 г.), на международной конференции «Ломоносов-2007» (Москва, 2007 г.), на четвертом международном симпозиуме по компьютерным методам в токсикологии и фармакологии (Москва, 2007 г.), биотехнологической выставке «РосБиоТех-2007», на третьей международной школе по молекулярному моделированию в биологии и науках о материалах (Дубна, 2008 г.) Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ, включая 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК для соискателей ученых степеней, 2 статьи находятся в печати.

Личный вклад автора. Соискатель принимал непосредственное участие в постановке задач, проведении расчетов, обработке и анализе результатов, подготовке статей и докладов на конференциях, а также в разработке программного обеспечения для проведения, обработки и анализа результатов экспериментов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа ( _ страниц) состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы ( _ ссылки), иллюстрирована _ рисунками и содержит _ таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы задачи работы, кратко охарактеризованы методы и их решения, отражены научная новизна и практическая значимость результатов.

В первой главе представлен краткий обзор литературы, посвященный биохимии и каналообразующему действию пептаиболов, в частности зервамицина IIB. Также проведен обзор работ по компьютерному моделированию длинного пептаибола – аламетицина.

Во второй главе описаны основные методики проведения вычислительного эксперимента, методами равновесной и управляемой молекулярной динамики и методики экспериментальных исследований для изучения динамики пептид-мембранных систем. Также рассмотрено влияние различных параметров МД-протокола на динамику исследуемых систем.

В третьей главе в полноатомном силовом поле исследована динамика зервамицина IIB и ряда его аналогов в воде и в метаноле и проведено сравнительное изучение стабильности спиральной структуры.

Молекула зервамицина IIB имеет следующую первичную последовательность:

Ace0-Trp1-Ile2- Gln3-Iva4-Ile5-Thr6-Aib7-Leu8-Aib9- -Hyp10-Gln11-Aib12-Hyp13-Aib14-Pro15-Phl16, где Aib - -аминоизомаслянная кислота, Iva – D-изовалин, Phl – Lфенилаланинол, Hyp – L-4-транс-гидроксипролин. Начальная структура зервамицина IIB была взята из Protein Data Bank (код структуры 1IH9).

В отличие от длинных пептаиболов, например аламетицина, которые не имеют определенной структуры вне поверхности мембраны, молекула зервамицина IIB обладает достаточно жесткой спиральной структурой в водном окружении и в метаноле. За 10 нс траектории среднеквадратичное отклонение (RMSD) С-атомов аминокислотных остатков составило порядка 1,4.

Также молекула ZrvIIB не совершает высокоамплитудных движений, изгибающих спираль (шарнирные движения), которые свойственны для длинных пептаиболов (Shenkarev Z.O. и др., 2004).

Для определения последовательности, отвечающей за амплитуду шарнирных движений, были изучены следующие 3 мутанта с заменами в области изгиба спирали: с заменой Aib-Gly в положении 7 (ZrvIIB-gly7) и (ZrvIIB-gly9) и с добавленным Gly в 8-е положение (ZrvIIB-gly8). Амплитуда шарнирных движений оценивалась с помощью распределения плотности вероятности расстояния между N- и C-концами пептидов для всех 4-х пептидов в двух растворителях (вода и метанол).

А Б В Рис. 1 А. Распределение расстояний между С-атомами первого и последнего остатков для молекулы зервамицина IIВ (при замене aib9 на gly9) в воде и в метаноле. Структура зервамицина IIВ с заменой aib9-gly9 в воде (Б) и в метаноле (В). (выделен Gly9) В нативном зервамицине IIB и зервамицине IIB с заменой Aib-Gly в 7ом и 9-ом положениях не наблюдается высокоамплитудных шарнирных движений изгибающих спираль. Отметим, что ZrvIIB-gly9 в метаноле компактизуется за счет изгиба в области Gly9 (Рис. 1) благодаря реорганизации водородных связей, в воде подобных структурных изменений не наблюдалось.

Добавление Gly в положение 8 полностью воссоздает консервативную последовательность Aib-Gly-Leu-Aib-Pro, ответственную за наличие высокоамплитудных движений в длинных пептаиболах. Для ZrvIIB-glyнаблюдается появление значительных флуктуаций длины пептида в метаноле, в воде амплитуда колебаний значительно меньше. Это свидетельствует о том, что данная замена делает зервамицин IIB чувствительным к полярности растворителя: при уменьшении полярности жесткость структуры уменьшается, и появляются движения, изгибающие спираль.

Рис. 2. Распределение плотности вероятности расстояния между С атомами первого и последнего остатка молекулы зервамицина IIВ с добавленным остатком gly в 8-е положение в воде и в метаноле.

Таким образом, в мутантах ZrvIIB-gly9 ZrvIIВ-gly8 наблюдаются определенные структурные изменения при уменьшении полярности растворителя. Это может критически повлиять на активность зервамицина II, так как длина молекулы ZrvIIВ составляет около 24, при наличии шарнирных движений длина молекулы может уменьшаться до 16, как в случае с ZrvIIB-gly9, что недостаточно для образования мембранного канала.

Также в данной главе определены водородные связи, которые отвечают за структурные изменения и подвижность в разных растворителях в каждом из четырех пептидов.

В четвертой главе изучалось взаимодействие молекулы зервамицина IIB с модельными мембранами эукариот и прокариот. В качестве модели эукариотической клетки использовался липидный бислой состоящий из молекул ПОФХ, а для моделирования мембраны бактериальной клетки липидный бислой из ПОФЭ и ПОФГ в соотношении 1:4. Проводились 2 типа эксперимента: равновесная МД для изучения связывания зервамицина IIB с поверхностью мембраны и управляемая МД для изучения процесса встраивания пептида в липидный бислой, причем внешнее ускорение прикладывалось к различным атомам пептида. В начальной конформации молекула ZrvIIB помещалась выпуклой (полярной) стороной к поверхности мембраны на расстоянии 0,7 нм. При изучении поверхностного связывания молекулы зервамицина IIB с мембраной особое внимание уделялось ориентации пептида относительно поверхности, стабильности спиральной структуры и образованию водородных связей между аминокислотными остатками и молекулами липидов.

Для определения положения пептида относительно поверхности мембраны в первые и последние 500 пс траектории было определено среднее положение С-атомов для каждого аминокислотного остатка молекулы зервамицина IIB относительно поверхности мембраны. Граница мембраны определялась как z координата (вдоль оси нормали мембраны) центра масс атомов фосфора.

При взаимодействии ZrvIIB с липидным бислоем ПОФХ молекула ориентируется параллельно поверхности мембраны вогнутой (неполярной стороной), при этом молекула ZrvIIB не взаимодействует с гидрофобными хвостами липидов, а остается в водном окружении, взаимодействуя с полярными головками липидов. Особую роль в стабилизации данной конформации пептида относительно мембраны играют остатки Gln3 и Gln11, которые взаимодействуют с полярными головками липидов и образуют три водородные связи. Остальные полярные аминокислотные остатки Thr6, Hyp10 и Hyp13 обращены в воду. Также наблюдается небольшое структурное изменение в области N-конца пептида, которое вызвано поворотом остатка Gln3 к поверхности мембраны.

А Б Рис. 3 Положение C-атомов относительно атомов фосфора липидных головок бислоя ПОФХ (А) и ПОФЭ/ПОФГ (Б) в начальной конформацим и после 10нс равновесной динамики Молекула зервамицина IIB за счет ориентации внутримолекулярных водородных связей, стабилизирующих спираль, обладает дипольным моментом, направленным от С-конца к N-концу и приблизительно равным 50D, что эквивалентно зарядам +0,4е и -0,4е на N- и C-концах.

Фосфатидилглицероловые липиды придают поверхности мембраны суммарный отрицательный заряд. Таким образом, N-конец молекулы ZrvIIB, несущий локальный положительный заряд, притягивается к поверхности мембраны, а С-конец удаляется от поверхности мембраны на расстояние ~ 1,7 нм. Внешнее электрическое поле также способствует такой ориентации пептида. Также как и в случае с мембраной ПОФХ, пептид взаимодействует исключительно с полярной частью мембраны, но в данном эксперименте Nконец входит в область липидных головок и образует как минимум четыре водородные связи с молекулами липидов. В образовании водородных связей с полярными головками липидов участвуют остатки Ace0, Gln3 и Thr6.

Pages:     || 2 | 3 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.