WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 |

У 7 из 10 зародышей возникновение мозаицизма было связано с коррекцией анеуплоидии мейотического происхождения до или после обособления цитотрофобласта и экстраэмбриональной мезодермы. У эмбрионов с мозаичными трисомиями по хромосомам 16 и 10 в обеих тканях (№ 4 и № 9, табл. 3) метилирование промоторного региона гена RB1 также присутствовало в производных обоих зародышевых листков, что может свидетельствовать о потенциальной значимости такого эпигенетического статуса данного гена в механизме коррекции трисомии. Ассоциация тканеспецифичного метилирования RB1 с коррекцией анеуплоидии прослеживалась и для эмбрионов № 5, 8 и 10: у всех этих зародышей метилированные последовательности были зарегистрированы в ткани с более интенсивными процессами коррекции трисомии, приводящими к значимому увеличению частоты эуплоидных клеток, по сравнению с другой тканью.

При рассмотрении всех возможных случаев формирования мозаицизма за счет коррекции трисомии частота эмбрионов с метилированными последовательностями RB1 в экстраэмбриональной мезодерме составила 27,8%, тогда как в цитотрофобласте хориона – только 5,7% (p = 0,04). Полученные данные указывают на то, что метилирование промоторного региона гена RB1 у анеуплоидных зародышей может являться одним из эпигенетических механизмов, который повышает шансы коррекции трисомии с восстановлением нормального числа хромосом.

При этом вероятность такого события оказывается выше для клеток производных внутренней клеточной массы, из которой впоследствии формируются все эмбриональные ткани. Не исключено, что подобный механизм может обеспечивать выживание некоторой части зародышей с аутосомными трисомиями за счет коррекции анеуплоидии непосредственно в эмбриональных клетках на ранних этапах развития с формированием ограниченного плацентарного мозаицизма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Настоящее исследование было направлено на оценку вклада аномалий эпигенетической регуляции активности генов в нарушение эмбрионального развития человека. Предпосылками к его проведению явились, с одной стороны, данные об интенсивных процессах эпигенетической реорганизации генома эмбриональных клеток на начальных этапах онтогенеза, а с другой стороны, отсутствие концепций, удовлетворительно объясняющих высокую частоту внутриутробной гибели зародышей с нормальным хромосомным набором. Исследование было сфокусировано на анализе изменчивости характера метилирования промоторных регионов генов, как одного из основных эпигенетических механизмов контроля их экспрессии. Предметом изучения явились импринтированные локусы генома, в регуляции экспрессии которых существенное значение отводится эпигенетическим механизмам, а также ряд генов, вовлеченных в контроль клеточного цикла.

Исследование проводилось на выборке спонтанных абортусов, кариотип которых был установлен и верифицирован с использованием комплекса цитогенетических, молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических методов анализа. В работе были предложены подходы, позволяющие учитывать возможность возникновения ошибок при проведении цитогенетического анализа клеток внутриутробно погибших зародышей человека, связанных с полиплоидизацией эмбриональных фибробластов при длительном культивировании in vitro, а также с контаминацией культур клетками материнского организма. В то же время необходимо отметить, что у части спонтанных абортусов с нормальным кариотипом могут иметься микроструктурные аберрации хромосом, выявить которые с использованием стандартного метафазного анализа не представляется возможным. Согласно результатам исследований, выполненных с помощью матричной сравнительной геномной гибридизации, доля таких эмбрионов может составлять 4-5 % (Schaeffer et al., 2004; Shimokawa et al., 2006).

Изменение баланса дозы родительских геномов вследствие наличия феномена геномного импринтинга признается весомым фактором, нарушающим ранние этапы онтогенеза млекопитающих. Вместе с тем, молекулярные и цитогенетические механизмы, приводящие к нарушению такого баланса в эмбриональном периоде развития человека, за исключением случаев пузырного заноса, до настоящего времени оставались практически неизученными. В настоящем исследовании был проведен поиск ОРД у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом, однако ни одного случая ошибочного наследования хромосом выявлено не было. При обобщении полученных данных с результатами аналогичных исследований было показано, что частота внутриутробно погибших эмбрионов с ОРД по хромосомам, несущим импринтированные гены, не превышает 0,5%.

Полученные результаты позволяют сделать заключение об отсутствии заметного влияния ОРД на нарушение эмбрионального развития человека. Однако данный вывод не снимает вопроса о роли мутаций импринтированных локусов генома в этиологии нарушений эмбрионального периода онтогенеза.

Учитывая, что экспрессия импринтированных генов контролируется эпигенетическими механизмами, в настоящей работе был проведен анализ дифференциального метилирования ряда импринтированных локусов хромосом 11 и 15.

Впервые у эмбрионов с нарушениями клеточной пролиферации обнаружено гипометилирование центра импринтинга KCNQ1OT1 на материнской хромосоме 11. Получены данные, свидетельствующие о возникновении эпимутаций на постимплантационных этапах развития. Принимая во внимания тот факт, что аналогичные эпимутации в локусе KCNQ1OT1 зарегистрированы практически у всех детей с синдромом Видемана-Беквита, родившихся в результате применения методов искусственного оплодотворения, результаты выполненного исследования подтверждают гипотезу о проявлении у потомства супружеских пар с репродуктивными проблемами скрытой генетической (или эпигенетической) изменчивости, несовместимой с нормальным развитием организма.

Еще одним ожидаемым эффектом аберрантных эпигенетических модификаций генома могло явиться увеличение частоты мутаций и в целом повышение нестабильности генома при нарушениях эмбрионального развития. С целью регистрации этих феноменов в настоящем исследовании были изучены мутации микросателлитных последовательностей ДНК и хромосомный мозаицизм в тканях внутриутробно погибших эмбрионов. Исследование микросателлитных локусов было сфокусировано на сравнительном анализе частоты мутаций гаметического и соматического происхождения при нарушении внутриутробного развития организма. Установлено, что мутации микросателлитных последовательностей ДНК возникают примерно с сопоставимой частотой в гаметах родителей, имеющих живорожденных детей, и в супружеских парах с невынашиванием беременности, тогда как соматические мутации микросателлитных последовательностей ДНК были выявлены исключительно в клетках спонтанных абортусов с нормальным хромосомным набором. Полученные данные свидетельствует о более высокой селективной значимости мутационной изменчивости микросателлитных локусов ДНК на постзиготических этапах онтогенеза человека.

Данные о мутационном процессе в эмбриональных клетках были дополнены результатами исследования хромосомного мозаицизма, возникновение которого также приходится на постзиготические этапы развития. С использованием интерфазного FISH-анализа была изучена частота анеуплоидных клеток и их распределение в производных различных зародышевых листков, что позволило определить механизмы и стадии развития, на которых произошло появление мозаичного кариотипа. В результате все эмбрионы были дифференцированы на две группы. Первую группу составили спонтанные абортусы с мозаичным кариотипом, сформированным вследствие ошибок митотической сегрегации хромосом в клетках зародышей, развивающихся из зигот с нормальным кариотипом. Примечательно, что у этих эмбрионов аномальное метилирование гена клеточного цикла RB1 было выявлено в производных трофэктодермы и внутренней клеточной массы, что свидетельствовало о раннем возникновении эпимутации, предшествующем событию хромосомного нерасхождения.

Во второй более многочисленной группе спонтанных абортусов возникновение мозаицизма было связано с коррекцией анеуплоидии мейотического происхождения. У этих зародышей также была продемонстрирована ассоциация аномального метилирования гена RB1 с возникновением хромосомного мозаицизма. Показано, что частота эпимутаций оказывается выше в тканях с более интенсивными процессами коррекции трисомии. При этом аномальное метилирование было выявлено преимущественно в экстраэмбриональной мезодерме, производной эпибласта, из которого формируются все эмбриональные структуры.

Возможно, что метилирование некоторых генов, вовлеченных в контроль клеточного деления и сегрегации хромосом, при аутосомных трисомиях мейотического происхождения повышает шансы коррекции анеуплоидии в эмбриональных клетках с восстановлением нормального хромосомного набора. Это предположение требует дополнительных исследований, вместе с тем, полученные в ходе настоящей работы данные относительно статуса метилирования еще одного гена клеточного цикла (CDKN2A) в плацентарных тканях контрольной группы зародышей указывают на значимость эпигенетической регуляции клеточного деления в обеспечении нормального эмбрионального развития.

Обобщая результаты исследования можно отметить, что нарушения эмбрионального периода онтогенеза человека сопровождаются повышением уровня мутационной изменчивости генома. Ее возникновение может являться следствием повреждения некоторых универсальных механизмов регуляции структурно-функциональной организации генома, в том числе и через аберрантные эпигенетические процессы. Наиболее вероятной причиной эпигенетических аномалий являются ошибки репрограммирования генома, приводящие к формированию аберрантных эпигенотипов, несовместимых с нормальным течением эмбрионального развития. Патогенетические механизмы нарушений развития эмбрионов с аномальными эпигенотипами могут быть связаны, как с повышением частоты мутаций в их соматических клетках, так и с повреждением эпигенетически контролируемых феноменов (в частности, геномного импринтинга), обеспечивающих нормальное течение эмбриогенеза.

ВЫВОДЫ 1. Впервые показано, что нарушение эмбрионального развития человека может быть обусловлено эпимутациями импринтированных генов. У 9,5% спонтанных абортусов выявлено тканеспецифичное гипометилирование центра импринтинга KCNQ1OT1 на материнском гомологе хромосомы 11. Тканеспецифичность эпимутаций свидетельствует об их соматическом происхождении после обособления экстраэмбриональных и зародышевых листков на постимплантационных этапах развития.

2. Предложена классификация эпимутаций импринтированных локусов генома человека, учитывающая стадии онтогенеза, на которых возникают нарушения характера метилирования, спектр функционально значимых эпигенетических модификаций, а также число затрагиваемых импринтированных генов.

3. Установлено, что однородительская дисомия хромосом 2, 9, 11, 15, 16, 19, и 21 не вносит заметного вклада во внутриутробную гибель эмбрионов человека с нормальным кариотипом.

4. Возникновение хромосомного мозаицизма при нарушениях эмбрионального развития преимущественно связано с механизмом коррекции анеуплоидии мейотического происхождения. Только у 10% эмбрионов мозаичная хромосомная конституция является следствием ошибок митотической сегрегации хромосом в соматических клетках зародыша, развивающегося из зиготы с нормальным кариотипом.

5. В плацентарных тканях спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом впервые выявлено метилирование промоторных регионов генов контроля клеточного цикла P14ARF и RB1 с частотой 9 и 20%, соответственно. Установлено, что эпимутации исследованных генов ассоциированы с риском тканеспецифичного хромосомного нерасхождения. Наличие эпимутаций в производных трофэктодермы и внутренней клеточной массы указывает на нарушение деметилирования родительских геномов в ходе их эпигенетического репрограммирования на преимплантационных этапах развития.

6. Впервые показано, что метилирование гена RB1 у эмбрионов с анеуплоидией мейотического происхождения повышает вероятность коррекции хромосомного нарушения с возникновением мозаицизма. Частота аберрантного метилирования оказывается статистически значимо выше в экстраэмбриональной мезодерме, по сравнению с цитотрофобластом хориона, что свидетельствует о более интенсивных процессах коррекции анеуплоидии в производных внутренней клеточной массы.

7. В цитотрофобласте хориона и экстраэмбриональной мезодерме эмбрионов человека в первом триместре беременности имеется метилирование промоторного региона и экзона I гена CDKN2A, что указывает на значимость эпигенетической регуляции активности данного локуса в обеспечении нормальной дифференцировки плацентарных тканей.

8. Частота гаметических мутаций в тетрануклеотидных повторяющихся последовательностях ДНК не отличается в потомстве супружеских пар с нормальной репродуктивной функцией и в семьях с невынашиванием беременности, тогда как у 4,2% спонтанных абортусов с нормальным кариотипом выявляются соматические мутации микросателлитных последовательностей.

9. Остановка внутриутробного развития эмбрионов человека в 54,5% случаев обусловлена аномалиями кариотипа, среди которых доминирующими оказываются числовые нарушения хромосом – трисомия аутосом, моносомия по Ххромосоме и полиплоидия. Установлено, что регистрация тетраплоидного кариотипа при цитогенетическом анализе в 57% случаев связана с полиплоидизацией эмбриональных клеток в ходе культивирования in vitro.

10. Показано, что контаминация культур эмбриональных фибробластов клетками материнского организма оказывает влияние на регистрируемую частоту нарушений кариотипа и на значение показателя соотношение полов у спонтанных абортусов с нормальным хромосомным набором, а также определяет достоверность цитогенетического анализа репродуктивных потерь в эмбриональном периоде развития.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Лебедев И.Н., Никитина Т.В., Суханова Н.Н., Назаренко С.А. Ранняя эмбриональная гибель: реальные масштабы мозаичных форм аномалий кариотипа // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. Новосибирск: Издательский дом «Манускрипт». 2001. Вып. 1. С. 49-57.

2. Островерхова Н.В., Назаренко С.А., Лебедев И.Н., Черемных А.Д., Никитина Т.В., Суханова Н.Н. Детекция анеуплоидии у спонтанных абортусов методом сравнительной геномной гибридизации // Генетика. 2002. Т. 38. № 12.

С. 1435-1442.

3. Суханова Н.Н., Лебедев И.H., Никитина Т.В., Саженова Е.А., Назаренко C.A.

Структура хромосомных нарушений у 552 спонтанных абортусов Томской популяции // Медицинская генетика. 2002. № 6. С. 271-276.

4. Лебедев И.Н., Назаренко С.А. Современные технологии молекулярной цитогенетики в диагностике хромосомных болезней человека // Молекулярнобиологические технологии в медицинской практике. Новосибирск: «АльфаВиста». 2002. Вып. 2. С. 74-88.

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.