WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |

Существенная часть мозаичных эмбрионов элиминирует уже на преимплантационных этапах развития, однако некоторые из них могут проходить имплантацию и продолжать свое развитие. Вероятность такого события зависит от типа хромосомной аномалии, вовлеченной в мозаичное состояние, от частоты аномальных клеток, а также от их локализации в производных различных зародышевых листков. Кроме того, возникновение мозаицизма возможно и на постимплантационных этапах развития. В рамках настоящего исследования был проведен анализ особенностей распределения анеуплоидных клеток в тканях эмбрионов с мозаичной хромосомной конституцией. На основе разработанной модели формирования хромосомного мозаицизма (Лебедев, Назаренко, 2001) было определено, что в подавляющем большинстве случаев (90%) возникновение мозаичного кариотипа являлось следствием коррекции анеуплоидии мейотического происхождения в одной или обеих обследованных тканях. У остальных эмбрионов возникновение мозаицизма было связано с аномалиями сегрегации хромосом в соматических клетках зародышей, развивающихся из эуплоидных зигот.

Далее спонтанные абортусы с хромосомным мозаицизмом были обследованы на предмет характера метилирования генов RB1, CDKN2A, CDKN2B и P14ARF, вовлеченных в RB- и P53-зависимые пути регуляции клеточного цикла.

Анализ проводили в ЦХ и ЭМ с целью определения тканеспецифичности эпимутаций и периодов их наиболее вероятного возникновения. У 9 из 45 эмбрионов (20%) впервые было зарегистрировано метилирование промоторной области гена RB1 (рис. 3). При этом у 5 зародышей метилированные последовательности были зарегистрированы как в ЭМ, так и в ЦХ, что свидетельствовало о возникновении эпимутаций ещё до обособления исследованных тканей (табл. 3).

Аберрантное метилирование промотора гена P14ARF (рис. 4) было выявлено у 4 из 45 спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом, что составило 9%. При этом у 2 эмбрионов оно оказалось ограниченным ЦХ, у одного эмбриона – ЭМ, еще у одного зародыша метилированные аллели выявлялись в обеих тканях (табл. 3). При анализе статуса метилирования гена CDKN2B у эмбрионов с хромосомным мозаицизмом ни одной эпимутации обнаружено не было. Метилирования генов RB1, P14ARF и CDKN2B также не было найдено в тканях спонтанных абортусов с нормальным кариотипом и в контрольной группе.

500 - - 404 - 331 - - 242 - - 190 - - 147 - 111 - - - - п.н.

п.н.

pUC19/ U M U M U M U M M U M U M U pUC19/ MspI 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 MspI Рис. 3. Электрофореграмма продуктов Рис. 4. Электрофореграмма продуктов метилспецифичной ПЦР промоторного метилспецифичной ПЦР промоторного региона гена RB1. региона гена P14ARF.

U – неметилированный аллель (172 п.н.); U – неметилированный аллель (132 п.н.);

M – метилированный алелль (172 п.н.); M – метилированный алелль (122 п.н.);

1 – геномная ДНК из лимфоцитов перифе- 1, 2 – геномная ДНК из ЦХ эмбриона с рической крови здорового индивида; хромосомным мозаицизмом с метилиро2 – геномная ДНК из лимфоцитов перифе- ванным и неметилированным аллелями;

рической крови, обработанная CpG- 3, 4 – геномная ДНК из ЭМ абортуса с метилазой M.SssI; мозаицизмом и неметилированными ал3, 4 – геномная ДНК из ЭМ медицинского лелями;

абортуса; 5 – геномная ДНК из лимфоцитов пери5, 6 – геномная ДНК из ЭМ эмбриона с мо- ферической крови здорового индивида, заицизмом и метилированными аллелями; обработанная CpG-метилазой M.SssI;

7, 8 – геномная ДНК из ЦХ эмбриона с мо- 6 – геномная ДНК из лимфоцитов перизаицизмом с неметилированным и метили- ферической крови здорового индивида.

рованным аллелями.

При исследовании характера метилирования гена CDKN2A с помощью метилспецифичной ПЦР у 22 из 36 эмбрионов контрольной группы (61%) были выявлены метилированные последовательности в составе экзона I. Для уточнения эпигенетического статуса этого гена в плаценте нормально развивающихся эмбрионов нами были проведены дополнительные исследования. С помощью метилчувствительной ПЦР после предварительного гидролиза геномной ДНК метилчувствительной эндонуклеазой HpaII, метилированные аллели были выявлены у всех 36 эмбрионов. Отличия между результатами исследования, полученными с помощью двух различных подходов, могут быть объяснены анализом 8 потенциальных сайтов метилирования (CpG-динуклеотиды) в составе экзона I в случае применения метилспецифичной ПЦР и только одного из этих 8 сайтов при использовании метилчувствительной ПЦР.

Имеются противоречивые данные относительно влияния метилирования последовательности экзона I гена CDKN2A на уровень его экспрессии. С одной стороны, сообщается о значимом снижении экспрессии гена при метилировании экзона (Huang et al., 2002; Xue et al., 2004). С другой стороны показано, что метилирование CpG-динуклеотидов в составе экзона I ассоциировано с присоединением метилцитозин-связывающего белка MeCP2, запускающего каскад реакций компактизации хроматина, однако это не препятствует транскрипции. Существенное снижение транскрипции наблюдается только в том случае, если метилирование затрагивает промоторный регион, где наряду с присоединением Таблица 3. Профили метилирования генов контроля клеточного цикла у спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом.

№ Цитотрофобласт хориона Экстраэмбриональная мезодерма Механизм Механизм статус метилирования статус метилирования возникновения возникновения Кариотип Кариотип мозаицизма эпимутаций RB1 P14 P15 P16exI RB1 P14 P15 P16exI 1 47,XY,+7/46,XY Митотическое Нарушение М/U М/U U/U М/U 46,XY М/М М/U U/U М/U (3:97) нерасхождение в ЦХ деметилирования 2 47,XX,+8/46,XX Митотическое Нарушение М/U М/U U/U М/U 46,XX М/U U/U U/U М/U (3:97) нерасхождение в ЦХ деметилирования 3 45,XY,-15/46,XY Анафазное Нарушение М/U U/U н/о М/U 46,XY М/U U/U н/о М/U (18:82) отставание в ЦХ деметилирования 4 47,XX,+16/46,XX 47,XX,+16/46,XX Коррекция Нарушение М/U U/U U/U М/U М/U U/U U/U М/U (52:48) (65:35) трисомии деметилирования 5 47,XY,+16/46,XY U/U U/U U/U М/U 47,XY,+16/46,XY Коррекция Аномальное метилиМ/U U/U U/U М/U (24:76) (5:95) трисомии рование RB1 в ЭМ 6 47,XX,+16/46,XX н/о U/U U/U U/U 47,XX,+16/46,XX Коррекция М/U U/U U/U U/U - (74:26) (81:19) трисомии 7 47,XY,+16/46,XY U/U М/U U/U М/U 47,XY,+16/46,XY Коррекция Аномальное метилин/о U/U U/U М/U (67:33) (82:18) трисомии рование P14 в ЦХ 8 47,XX,+9/46,XX 47,XX,+9/46,XX Коррекция Аномальное метилиU/U U/U U/U М/U М/U U/U U/U М/U (72:28) (60:40) трисомии рование RB1 в ЭМ 9 47,XX,+10/46,XX 47,XX,+10/46,XX Коррекция Нарушение М/U U/U U/U М/U М/М М/U U/U М/U (18:82) (30:70) трисомии деметилирования 10 47,XYY/46,XY Коррекция Аномальное метилиМ/U н/о н/о н/о 47,XYY U/U н/о н/о н/о (68:32) анеуплоидии в ЦХ рование RB1 в ЦХ Примечание: в скобках указано соотношение клеточных клонов в %, установленное с помощью интерфазного FISH-анализа некультивированных клеток; н/о – не обследован; M (Methylated) – метилированный аллель; U (Unmethylated) – неметилированный аллель; P14 – промоторный регион гена P14ARF; P15 – промоторный регион гена CDKN2B (P15INK4B); P16exI – экзон I гена CDKN2A (P16INK4A).

MeCP2 происходит деацетилирование гистонов и ремоделирование хроматина (Nguyen et al., 2001). Нами был проведен анализ характера метилирования промоторной области гена CDKN2A с помощью метилчувствительной ПЦР. У всех 36 эмбрионов контрольной группы были выявлены метилированные последовательности. Таким образом, метилирование наблюдалось как в экзоне I, так и в промоторном регионе.

Полученные данные позволяют выдвинуть предположение о значимости эпигенетической регуляции активности гена CDKN2A в плацентарных тканях.

Следует отметить, что в литературе имеются сообщения о метилировании ряда опухолесупрессорных генов (PTEN, RASSF1A) в плаценте человека на протяжении нормально протекающей беременности (Chen et al., 2005; Chiu et al., 2007).

Высказывается гипотеза, что такой эпигенетический статус генов может обеспечивать необходимый инвазивный и пролиферативный потенциал клеток плаценты (Chiu et al., 2007). Что касается гена CDKN2A, то его метилирование описано в 20,4% случаев пузырного заноса и в 40% хорионкарцином (Xue et al., 2004), а также у 14% спонтанных абортусов с нормальным кариотипом (Park et al., 2008).

Однако, при анализе 10 плацент нормально развивающихся эмбрионов I триместра беременности в одном из исследований (Xue et al., 2004), 5 плацент I-го и плацент III-го триместров в другой работе (Chiu et al., 2007) метилирования данного гена обнаружено не было. Необходимо отметить, что во всех этих работах на небольших по объему выборках анализировался исключительно экзон I и только с помощью метилспецифичной ПЦР. Что касается частоты метилирования последовательности из 8 CpG-динуклеотидов в составе экзона I гена CDKN2A у спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом, то в нашем исследовании она составила 76% и статистически значимо не отличалась от соответствующего показателя (61%) в контрольной группе (p = 0,28).

Таким образом, информативными для анализа связи аберрантного метилирования генов клеточного цикла с возникновением мозаицизма оказались гены RB1 и P14ARF, эпимутации которых были обнаружены у 10 из 50 спонтанных абортусов с мозаичным кариотипом (табл. 3). Отсутствие или недостаток протеина pRB в клетке приводит к изменению уровня основных белков-регуляторов клеточного цикла (CDC20, MAD2, циклины B и E) и, как следствие, к появлению разрывов хромосом, мостов, анеу- и полиплоидии (Knudsen, Knudsen, 2006).

Кроме того, нарушение взаимодействий pRB c хроматин-ремоделирующими факторами (HDAC1-3, DNMT, BRC1) обусловливает дефекты центромерного гетерохроматина и нерасхождение хромосом (Gonzalo et al., 2005). Белковый продукт гена P14ARF связывает P53 и RB-зависимые пути регуляции клеточного цикла, препятствуя взаимодействию Mdm2 и pRB белков, что приводит к накоплению последнего и остановке клеточного цикла. Уменьшение количества или полное отсутствие р14 приводит к снижению уровня pRB (Chang et al., 2007).

С целью определения характера связи между метилированием исследованных генов и возникновением мозаицизма нами были изучены особенности распределения клеток с эпимутациями и с хромосомными нарушениями в производных различных зародышевых листков (трофэктодермы и эпибласта), обособляющихся в период имплантации бластоцисты и характеризующихся разной динамикой установления метилирования. Геном клеток трофэктодермы подверга ется незначительному метилированию на постимплантационных этапах развития, тогда как уровень метилирования ДНК в производных эпибласта, из которого впоследствии будут развиваться все эмбриональные структуры, существенно возрастает (рис. 1).

Известно, что анеуплоидия в эмбриональных клетках может являться следствием нерасхождения гомологичных хромосом в гаметогенезе у родителей, либо возникать при митотическом делении соматических клеток зародыша. Однако появление мозаицизма всегда является результатом митотических ошибок на постзиготических этапах развития. При этом если зигота имеет нормальный кариотип, то митотическое нерасхождение хромосом будет продуцировать два клона клеток – с трисомией и моносомией. Поскольку клетки с моносомией аутосом обычно не жизнеспособны, то в дальнейшем в организме будут присутствовать только два типа клеток - с нормальным кариотипом и с трисомией. Маркером митотического нерасхождения в этом случае будет являться невысокая доля анеуплоидного клона, ограниченного, как правило, одним типом ткани. Альтернативным механизмом возникновения мозаицизма может являться анафазное отставание хромосомы, приводящее к появлению моносомных клеток, что и было обнаружено в одном из обследованных нами случаев (№ 3, табл. 3).

В случае наличия трисомии в зиготе, мозаицизм может быть следствием анафазного отставания дополнительной хромосомы на постзиготических этапах развития. Этот механизм, известный как «коррекция трисомной зиготы» (Kalousek, 2000), также приводит к формированию двух клеточных клонов – с трисомией и с нормальной хромосомной конституцией. Нерасхождение в случае трисомного кариотипа зиготы даст нормальный клеточный клон и тетрасомию, которая обнаруживается в эмбриональных клетках достаточно редко. Маркером коррекции выступает небольшой процент эуплоидных клеток, присутствующих в одном или в нескольких типах тканей. Однако частота таких клеток в определенной степени зависит и от стадии развития, на которой произошла коррекция, а также от пролиферативной активности нормальных и анеуплоидных клеток.

В проведенном нами исследовании суммарная частота эпимутаций генов RB1 и P14ARF статистически значимо возрастала от 2,610-2 на аллель в группе спонтанных абортусов с высоким уровнем анеуплоидных клеток до 32,510-2 на аллель у абортусов с низким уровнем анеуплоидных клеток в обследованных тканях (p < 0,05). Кроме того, эпимутации обнаруживались у абортусов с преимущественной локализацией анеуплоидных клеток либо в экстраэмбриональной мезодерме, либо в цитотрофобласте хориона. При этом ни одного случая аберрантного метилирования промоторных регионов исследованных генов у абортусов с равномерным распределением анеуплоидных клеток в производных двух зародышевых листков зарегистрировано не было. Полученные данные свидетельствуют об ассоциации тканеспецифичного хромосомного мозаицизма с аномальным метилированием генов контроля клеточного цикла.

У эмбрионов с тканеспецифичными хромосомными нарушениями, ограниченными цитотрофобластом (№ 1-3, табл. 3), возникновение мозаицизма было связано с ошибками митотической сегрегации хромосом на постимплантационных этапах дифференцировки трофэктодермы. При этом у всех зародышей метилирование RB1 было выявлено как в цитотрофобласте, так и в экстраэмбрио нальной мезодерме, что свидетельствовало о возникновении эпимутации еще до выделения трофобласта и внутренней клеточной массы, и, соответственно, до появления хромосомного нарушения. Поскольку обособление трофэктодермы и внутренней клеточной массы происходит во время имплантации бластоцисты на фоне гипометилированного состояния генома, полученные данные указывают на нарушение процесса деметилирования родительских геномов при эпигенетическом репрограммировании в преимплантационном периоде.

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.