WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |

- импринтированные гены, метилируемые на отцовских хромосомах;

- отцовский геном (неимпринтированные локусы);

- импринтированные гены, метилируемые на материнских хромосомах;

- материнский геном (неимпринтированные локусы);

- импринтированные гены, неметилируемые на материнских хромосомах;

- импринтированные гены, неметилируемые на отцовских хромосомах.

Цифрами обозначены критические периоды репрограммирования импринтированных генов.

ческие и соматические эпимутации. Наконец, третий критерий дифференцирует эпимутации по их функциональной значимости: гипер- либо гипометилирование импринтированных локусов, приводящее к потере импринтинга. В таблице представлен спектр теоретически ожидаемых эпимутаций, основанный на комбинации двух критериев (происхождение и функциональная значимость), а также приведены примеры некоторых наследственных и онкологических заболеваний, в этиологии которых была продемонстрирована роль нарушений характера метилирования импринтированных генов.

С целью установления вклада эпимутаций импринтированных локусов в нарушение эмбрионального развития был проведен анализ статуса метилирования трех центров импринтинга (SNURF-SNRPN, H19, KCNQ1OT1), координирующих экспрессию кластеров импринтированных генов на хромосомах 11 и 15, а также импринтированного гена CDKN1C, вовлеченного в контроль дифференцировки плацентарных тканей. В обоих типах внезародышевых тканей (ЭМ и ЦХ) у всех эмбрионов был выявлен дифференциальный характер метилирования SNURF-SNRPN, H19 и CDKN1C. На электрофореграммах выявлялось два продукта метилспецифичной ПЦР, соответствующих неметилированному отцовскому и метилированному материнскому аллелям SNURF-SNRPN, либо неметилированному материнскому и метилированному отцовскому аллелям H19 и CDKN1C.

Таблица 2. Классификация эпимутаций импринтированных генов.

Тип эпимутаций Аберрантное Аберрантное гипометилирование гиперметилирование материнского отцовского материнского отцовского аллеля аллеля аллеля аллеля Ошибки стира- IGF2/H19 ЦИ-СПВ ния импринтин- (СВБ) (СПВ);

га с сохранени- PEG1/MEST ем метильных (СРС) групп (КП 1).

Отсутствие ме- БППЗ; IGF2/Hтилирования ЦИ-СПВ (СЭ); (СРС) аллелей, кото- LIT1 (СВБ, рые должны ТНСД);

подвергаться ZAC (ТНСД, метилированию СВБ) (КП 2).

Аберрантное IGF2/H19 ЦИ-СПВ метилирование (СВБ) (СПВ);

аллелей, кото- PEG1/MEST рые не должны (СРС) метилироваться (КП 2).

Нарушение за- ЦИ-СПВ (мо- частичное щиты метили- заичные вари- гипометированных алле- анты СЭ); лирование лей от демети- «синдром ма- IGF2/Hлирования при теринского ги- (СРС) репрограммиро- пометилировавании генома ния»; мозаич(КП 3). ные варианты ТНСД Нарушение LIT1 (карци- P73 (карци- IGF2/H19 ЦИ-СПВ поддержания нома пищево- нома почек, (опухоль (мозаичные дифференци- да, рак пече- рак легкого) Вильмса, ге- варианты ального мети- ни); патобласто- СПВ);

лирования им- PEG3 (хорион- мы, рак лег- PEG3 (рак принтирован- карцинома) ких, почек); шейки матки ных генов в со- P73 (острая и эндометматических лейкемия, рия);

клетках лимфома Бер- ZAC (рак (КП 4). китта); яичников) GTL2 (карцинома почек) Примечание: БППЗ – биродительский полный пузырный занос; СВБ – синдром Видемана-Беквита; СПВ – синдром Прадера-Вилли; СРС – синдром Рассела-Сильвера; СЭ – синдром Энгельмана; ТНСД – транзиторный неонатальный сахарный диабет; ЦИ-СПВ – центр импринтинга хромосомы 15, мутации которого ответственны за формирование синдромов Прадера-Вилли и Энгельмана; КП – критические периоды репрограммирования в соответствии с рис. 1; прочерками обозначены несуществующие типы эпимутаций.

Гаметические эпимутации Соматические эпимутации Что касается центра импринтинга KCNQ1OT1, то у 8 из - 84 спонтанных абортусов KCNQ1OT- (9,5%) было зарегистрироваконтрольный - локус KvLно его гипометилирование на - материнском гомологе. Сви- детельством гипометилиро- вания явилось отсутствие на - электрофореграмме продукта п.н.

метилчувствительной ПЦР 1 2 3 4 5 pUC19/ размером 400 п.н., соответстMspI вующего материнскому меРис. 2. Электрофореграмма продуктов метилтилированному аллелю чувствительной ПЦР локуса KCNQ1OT1.

KCNQ1OT1 (рис. 2). Ампли1 – материнский метилированный аллель в ЦХ эм- фикация нативной ДНК, не бриона с низкой пролиферативной активностью обработанной рестриктазой клеток in vitro;

NotI, приводила к синтезу 2 – гипометилирование материнского аллеля в ЭМ продукта, исключая возможтого же эмбриона;

ность делеции данного локу3 – гипометилирование материнского аллеля в ЦХ са на материнской хромосоэмбриона с гиперплазией трофобласта;

ме. Теоретически аналогич4 – материнский метилированный аллель в ЭМ того ная картина результатов меже эмбриона;

тилчувствительной ПЦР мог5 – материнский метилированный аллель в ЦХ мела наблюдаться и при однодицинского абортуса.

родительском наследовании хромосомы 11 от отца, поскольку в этом случае на электрофореграмме также отсутствовали бы метилированные аллели материнского происхождения. Однако у всех эмбрионов наличие ОРД представляется маловероятным событием, поскольку статус метилирования двух других импринтированных генов в регионе 11p15.5 (H19 и CDKN1C) являлся нормальным. Таким образом, выявленные изменения характера метилирования KCNQ1OT1 следует рассматривать как эпимутации.

При сравнительном анализе метилирования KCNQ1OT1 в разных тканях было отмечено, что у 7 из 8 абортусов обнаруженные эпимутации затрагивали производные только одного зародышевого листка, т.е. регистрировались либо в ЭМ (5 эмбрионов), либо в ЦХ (2 зародыша). Ещё у одного абортуса для обследования оказалась доступной только ЭМ. Учитывая, что обособление и дифференцировка ЦХ и ЭМ происходит уже после этапа имплантации бластоцисты и завершения тотального деметилирования генома, полученные в ходе исследования данные о тканеспецифичности эпимутаций указывают на их соматическое происхождение. Наиболее вероятным механизмом возникновения таких эпимутаций является потеря эмбриональными клетками способности к поддержанию родительского импринтинга через нарушение воспроизводства характера метилирования ДНК в регуляторных последовательностях импринтированных генов на постимплантационных этапах развития (критический период № 4, рис. 1).

Гипометилирование KCNQ1OT1 на материнском гомологе является одной из наиболее частых форм молекулярной патологии, выявляемой у 50% пациентов с синдромом Видемана-Беквита (DeBaun et al., 2003). Более того, оно отмечено практически у всех детей с данным синдромом, родившихся в результате применения методов искусственного оплодотворения (Maher, 2005). Обсуждаемый в современной литературе вопрос о возможном влиянии вспомогательных репродуктивных технологий на увеличение риска рождения детей с болезнями геномного импринтинга (Niemitz, Feinberg, 2004; Дыбан А.П., Дыбан П.А., 2006) делает актуальными исследования механизмов и факторов, вызывающих эпимутации импринтированных генов. Доминирующей гипотезой является предположение о том, что используемые для культивирования гамет и эмбрионов среды, а также протоколы гормональной гиперстимуляции яичников, могут не обеспечивать нормального установления и поддержания геномного импринтинга в период тотальных эпигенетических модификаций генома половых и соматических клеток (Khosla et al., 2001; Lucifero et al., 2004). Полученные в ходе проведенного нами исследования данные указывают на то, что эпимутации, по крайней мере в локусе KCNQ1OT1, могут регистрироваться и при спонтанном прерывании беременностей, наступивших естественным путем. Эти результаты свидетельствуют в пользу альтернативной гипотезы, согласно которой технологии искусственного оплодотворения, позволяя преодолевать некоторые репродуктивные барьеры, могут приводить к проявлению у потомства скрытой генетической (или эпигенетической) изменчивости, в том числе и несовместимой с нормальным течением эмбриогенеза (Horsthemke, Ludwig et al., 2005). Возможно, что некоторые супружеские пары с нарушениями фертильности или невынашиванием беременности имеют предрасположенность к эпигенетической нестабильности, что делает геном их потомства подверженным эпигенетическим изменениям, независимо от того, использовались или нет методы искусственного оплодотворения.

Анализ мутаций микросателлитных последовательностей ДНК при нарушении эмбрионального развития С целью характеристики уровня мутационной изменчивости генома при ранней остановке внутриутробного развития в настоящем исследовании был проведен анализ частот гаметических и соматических мутаций микросателлитных последовательностей ДНК, а также хромосомного мозаицизма в клетках спонтанных абортусов первого триместра беременности. Для изучения вопроса о вкладе гаметических мутаций микросателлитных локусов ДНК в этиологию нарушений внутриутробного развития нами был выполнен анализ сегрегации аллелей 15 тетрануклеотидных повторяющихся последовательностей в семьях с невынашиванием беременности (при нормальном кариотипе у спонтанного абортуса) и в супружеских парах с нормальной репродуктивной функцией. В исследованных выборках гетерозиготность всех изученных локусов варьировала от 0,80 до 0,94, а число выявленных по каждому локусу аллелей колебалось от 6 до 17. Распределение частот генотипов не отличалось от ожидаемого при равновесии Харди-Вайнберга (p > 0,05).

В семьях с невынашиванием беременности было проанализировано информативных результатов мейоза и обнаружено 10 мутаций – две мутации в локусе D16S2624, по одной мутации – в 8 локусах. Средняя частота мутаций составила 4,3610-3 на локус/гамету/поколение. В семьях с нормальной репродуктивной функцией было изучено 1725 событий передачи аллелей микросателлитных локусов от родителей потомкам и выявлено 4 мутации в 4 разных локусах - D17S1185, D19S394, D21S11 и D21S1435. Средняя частота мутаций всего ком плекса изученных микросателлитных ДНК-маркеров составила 2,3210-3 на локус/гамету/поколение. Достоверных различий по частоте гаметических мутаций между исследованными группами семей не обнаружено (p = 0,25). Полученные данные свидетельствуют о том, что мутации в микросателлитных локусах ДНК в половых клетках родителей потомства с остановкой внутриутробного развития и у родителей живорожденных детей возникают с одинаковой частотой.

Следующим разделом работы явился анализ мутаций микросателлитных последовательностей ДНК, возникающих непосредственно в соматических клетках самих эмбрионов. При обследовании 95 спонтанных абортусов с нормальным кариотипом у 13 зародышей было обнаружено наличие дополнительного аллеля микросателлитного локуса, отличающегося по размеру от двух родительских аллелей, что указывало на возможные соматические мутации. Однако дополнительный интерфазный FISH-анализ показал, что в 4 случаях эмбрионы имели триплоидный кариотип, невыявленный вследствие материнской контаминации. Еще у 5 зародышей были найдены трисомии по хромосомам 16 или 20, в том числе и в мозаичном состоянии с нормальной клеточной линией. Таким образом, наличие соматических мутаций было подтверждено только у 4 из 95 эмбрионов (4,2%). Из 10 изученных локусов мутации были зарегистрированы в четырех, при этом в локусе D20S168 было выявлено два мутационных события, по одной мутации найдено в локусах D16S2624, D16S685 и D21S1413. Один эмбрион имел соматические мутации в двух локусах.

В среднем частота соматических мутаций тетрануклеотидных повторов ДНК у спонтанных абортусов составила 5,9610-3 на локус/поколение (5 мутаций в 839 обследованных генотипах). В то же время в 504 проанализированных генотипах эмбрионов контрольной группы ни одной мутации постзиготического происхождения обнаружено не было (p = 0,01). При сравнительном анализе частот гаметических и соматических мутаций в обследованных выборках достоверных отличий между ними не наблюдалось (p = 0,57). Этот факт, с одной стороны, подчеркивает то, что в основе возникновения мутаций микросателлитных последовательностей в половых и соматических клетках, по-видимому, лежат повреждения общих механизмов репарации ДНК. С другой стороны, наличие соматических мутаций исключительно у внутриутробно погибших эмбрионов свидетельствует о более высокой селективной значимости мутационной изменчивости микросателлитных локусов ДНК на постзиготических этапах развития.

Как правило, появление мутаций микросателлитных последовательностей служит индикатором функциональных нарушений в системе репарации ошибочного спаривания оснований ДНК. Полученные данные подтверждают гипотезу об ассоциации нарушений мисс-матч репарации ДНК в соматических клетках с ранней эмбриолетальностью у человека (Kiaris et al., 1996). Возможно, что нестабильность генома, выявляемая на уровне повторяющихся последовательностей ДНК, затрагивает не только генетически нейтральные локусы, но и участки генома, играющие существенную роль в раннем развитии организма.

Эпигенетические модификации генов клеточного цикла у эмбрионов с хромосомным мозаицизмом Хромосомный мозаицизм, определяемый как наличие у организма, развившегося из одной зиготы, двух или более клеточных линий с разным кариотипом является следствием нарушений сегрегации хромосом при митотическом деле нии клеток. Согласно результатам стандартных цитогенетических исследований, около 13-20% спонтанных абортусов имеют мозаичные нарушения кариотипа, ограниченные производными различных зародышевых листков (Kalousek et al., 1992; Lombardi, Dev, 1992; Griffin et al., 1997). Однако наиболее существенное возрастание частоты мозаицизма наблюдается на преимплантационных этапах дробления бластомеров, когда около 60% зародышей на стадии 8-клеточной морулы демонстрируют мозаичную хромосомную конституцию (Los et al., 2004).

Столь высокая частота хромосомного мозаицизма позволяет рассматривать его в качестве одной из форм нестабильности эмбрионального генома. Следует отметить, что увеличение частоты мозаичных кариотипов приходится на период тотального эпигенетического репрограммирования генома на преимплантационных стадиях развития. Возможно, что деметилированное состояние гетерохроматина негативным образом сказывается на точности хромосомной сегрегации, а нарушения последующих этапов установления метилирования ДНК могут приводить к аберрантной эпигенетической инактивации генов, ответственных за контроль клеточного цикла и распределение хромосом.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.