WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 7 |

Хромосомные нарушения выявлены у 391 эмбриона (54,5%). Наиболее частыми аномалиями кариотипа оказались трисомии аутосом – их частота составила 35,8% от всех выявленных хромосомных аберраций. Далее следовала тетраплоидия, частота которой (23,8%) заметно превышала известные в литературе значения – от 1,7% (Takahara et al., 1977) до 14% (Kalousek, 1993). Наиболее вероятными причинами такого отличия могут служить полиплоидизация эмбриональных фибробластов в длительных культурах in vitro, а также учет тетраплоидно-диплоидного мозаицизма. Так, 73 из 93 эмбрионов с тетраплоидным кариотипом по результатам цитогенетического анализа имели дополнительную эуплоидную клеточную линию, тогда как только у 20 спонтанных абортусов (22%) были выявлены исключительно тетраплоидные клетки. Таким образом, среди всех спонтанных абортусов с хромосомными аномалиями только 5% эмбрионов имели немозаичный вариант тетраплоидного кариотипа. Интерфазный FISHанализ некультивированных тканей 30 эмбрионов с тетраплоидным кариотипом в чистой или мозаичной форме позволил зарегистрировать тетраплоидные клетки только у 13 зародышей (43%). У всех этих эмбрионов частота тетраплоидных клеток статистически значимо превышала верхнюю границу предела обнаружения мутации (1,40% для ЦХ и 0,99% для ЭМ). Экстраполируя полученные данные на всю обследованную выборку спонтанных абортусов можно заключить, что частота тетраплоидии в группе эмбрионов с нарушениями кариотипа снизится с 23,8 до 10,2%, что находится в соответствии с данными литературы.

Частота триплоидии в проведенном исследовании составила 20,5%. Нарушения числа половых хромосом найдены в 11,7% случаев, при этом на долю моносомии по Х-хромосоме (в чистой и мозаичной форме) пришлось 6,6% выявленных аномалий кариотипа. Частота структурных перестроек хромосом составила 2,8%. В целом полученные данные по спектру и частоте основных типов хромосомных аномалий (с учетом коррекции частоты тетраплоидии) соответствуют результатам наиболее масштабных цитогенетических исследований спонтанных абортусов (Boue et al., 1975; Hassold et al., 1980; Kline et al., 1987; Kalousek, 1993; Griffin et al., 1997; Menasha et al., 2005).

Необходимо отметить, что полиплоидизация клеток является не единственным феноменом, влияющим на достоверность цитогенетического исследования при анализе репродуктивных потерь в эмбриональном периоде развития. Еще одним заметным фактором может выступать контаминация культур клетками материнского происхождения, затрагивающая, по разным оценкам, от 15 до 40% культур спонтанных абортусов с кариотипом 46,ХХ (Griffin et al., 1997; Bell et al., 1999). Предполагается, что материнская контаминация (МК) может приво дить к занижению частоты регистрируемых нарушений кариотипа, а также к уменьшению показателя «соотношение полов» в исследуемой выборке. Учитывая необходимость анализа спонтанных абортусов с нормальным кариотипом для решения задач, связанных с изучением эпигенетических феноменов, нами была разработана математическая модель для оценки частот кариотипов и достоверности цитогенетического исследования с учетом риска МК. Для построения модели предложено использовать коэффициент материнской контаминации (k), равный вероятности обнаружения последовательностей ДНК Y-хромосомы в некультивированных тканях спонтанных абортусов с кариотипом 46,ХХ, установленным после культивирования клеток. В таблице 1 приведены итоговые формулы для расчета ожидаемых частот кариотипов и определения достоверности проведенного цитогенетического анализа с учетом материнской контаминации. Полное математическое обоснование модели изложено в тексте диссертации, а также в публикациях (Никитина и др., 2004; Nikitina et al., 2005).

С помощью анализа локуса амелогенина у 18 из 112 эмбрионов с кариотипом 46,ХХ, установленным в результате цитогенетического исследования, было обнаружено наличие ДНК Y-хромосомы в некультивированных тканях (k = 16%). Отмечено, что продолжительность пролиферации клеток этих спонтанных абортусов до момента фиксации культур и приготовления хромосомных препаратов оказалась статистически значимо выше, чем продолжительность культивирования клеток эмбрионов, не продемонстрировавших наличие последовательностей Y-хромосомы в некультивированных тканях (35,08±3,98 и 24,05±1,дней, соответственно, p = 0,02). Таким образом, позднее вступление клеточных культур в фазу активной пролиферации, на которой обычно получают препараты метафазных хромосом, может являться маркером МК и требует особого внимания в случае установления повышенной частоты эмбрионов с кариотипом 46,ХХ в исследуемой выборке и при уменьшении показателя соотношения полов.

С целью определения пропорций кариотипов, маскируемых МК, к части цитогенетически обследованной группы эмбрионов (N=450) была применена предложенная модель. Показано, что с учетом МК частота хромосомных аномалий среди зародышей женского пола в исследованной выборке увеличилась с 51,5 до 62,2% (p = 0,01). Также была отмечена тенденция к возрастанию частоты нарушений кариотипа в общей выборке – с 51,8 до 57,8% (p = 0,07). Кроме того, наблюдалось увеличение показателя «соотношение полов» в группе спонтанных абортусов с нормальным кариотипом – с 0,66 до 1,02 (p = 0,03). Необходимо отметить, что статистическая значимость всех регистрируемых изменений определяется величиной коэффициента k и объемом исследуемой выборки N.

Верификация предложенной модели была проведена с помощью анализа наследования аллелей 16 полиморфных тетрануклеотидных ДНК-локусов, расположенных на хромосомах 2, 11, 16, 19, 20 и 21, в 60 семьях, имевших спонтанный аборт с кариотипом 46,ХХ, установленным после культивирования клеток.

Согласно модели, ожидаемая частота нарушений кариотипа при k = 16% должна составлять 20,7% (табл. 1), т.е. у 12 эмбрионов можно предполагать наличие невыявленных вследствие МК хромосомных аберраций. Использованный набор микросателлитных ДНК-маркеров позволяет детектировать как триплоидии, так и наиболее частые у спонтанных абортусов трисомии по хромосомам 16 и 21. В среднем, эти аномалии составляют около 40% регистрируемых нарушений кариотипа. Следовательно, с помощью данного подхода могли бы быть выявлены Таблица 1. Моделирование частот кариотипов и вероятности ошибки цитогенетического анализа спонтанных абортусов с учетом риска контаминации эмбриональных культур клетками материнского организма.

Показатель Наблюдае- Ожидаемое значение мое значение A(1- k) - ABk / N Частота кариотипа 46,XX A / N C + D Ak Частота кариотипа 46,XY C / N C1+ C + D / N Ak Частота эмбрионов женского по- B / N B1+ C + D / N ла с хромосомными аномалиями Частота эмбрионов мужского Ak пола с хромосомными D / N D1+ C + D / N аномалиями Ak Частота хромосомных аномалий (B+D) / N (B + D)1+ C + D / N в общей выборке k(B + D) Частота хромосомных аномалий в группе «46,XX» C + D Ak ABk Соотношение полов у эмбрионов C / A C1+ C + D /A(1- k)- C + D с нормальным кариотипом Вероятность обнаружения любого из вариантов хромосомAk ного набора (B, C или D), про- Ak + C + D пущенного при цитогенетическом анализе вследствие МК (Q) Доля эмбрионов с истинным кариотипом 46,ХХ в выборке ABk спонтанных абортусов с кариоA(1- k) - типом 46,ХХ, установленным C + D после культивирования клеток (Afn - female normal) Доля кариотипов «46,ХХ», A - Afn (1- Q) выявленных при анализе A материнских клеток (М) Частота эмбрионов с иным Ak(B + C + D) хромосомным набором в исследованной выборке N(C + D) (вероятность ошибки, E) Ak(B + C + D) Точность цитогенетического W = 1- E = 1- анализа (W) N(C + D) Примечание: А – число абортусов с кариотипом 46,ХХ в обследованной выборке; В – число абортусов женского пола с хромосомными аномалиями; С – число абортусов с кариотипом 46,XY; D – число абортусов мужского пола с хромосомными аномалиями; N – объем выборки (N = A+B+C+D).

не менее 5 из 12 ожидаемых эмбрионов с хромосомными аберрациями. В действительности числовые нарушения хромосом были найдены у 9 спонтанных абортусов (4 случая триплоидии, 4 трисомии по хромосоме 16 и двойная трисомия по хромосомам 16 и 20). Все аномалии были подтверждены интерфазным FISH-анализом с центромероспецифичными ДНК-зондами. У двух эмбрионов женского пола с трисомией по хромосоме 16 был установлен мозаицизм с наличием нормальной клеточной линии (с частотой 24% и 92%). Клетки с нормальным кариотипом могли иметь преимущество при длительном культивировании in vitro, поэтому ошибочный результат цитогенетического анализа мог быть связан как с МК, так и с мозаицизмом. У остальных 7 эмбрионов хромосомные аномалии присутствовали в немозаичном состоянии, свидетельствуя о том, что цитогенетический анализ этих зародышей был выполнен на материнских клетках, случайным образом попавших в культуры. Таким образом, числовые нарушения хромосом, невыявленные вследствие МК, были обнаружены как минимум у 7 из 60 абортусов с кариотипом 46,ХХ (11,7%), что хорошо согласуется частотой 8,3%, предсказанной моделью и дизайном экспериментальной проверки (p = 0,54). В целом, точность цитогенетического анализа (W) при использованных в настоящей работе условиях культивирования клеток составила 91,8%.

Мутации импринтированных локусов генома при патологии эмбрионального развития С целью изучения вклада однородительского наследования хромосом в раннюю эмбриональную гибель в настоящем исследовании был проведен анализ наследования 25 полиморфных тетрануклеотидных ДНК-маркеров, локализованных на хромосомах 2, 9, 11, 15, 16, 19, 20 и 21, в 100 семьях с невынашиванием беременности при нормальном кариотипе в клетках спонтанного абортуса. В ходе анализа из дальнейшего исследования были исключены четыре семьи, в которых было выявлено несоответствие аллелей микросателлитных локусов у отца и эмбриона («ложное» отцовство), а также 9 зародышей, продемонстрировавших отклонения от нормального числа хромосом, причиной которых послужила контаминация культур клетками матери, либо хромосомный мозаицизм. Таким образом, анализ ОРД был проведен у 87 эмбрионов. Ни одного случая ОРД по исследованным хромосомам при информативности анализа, варьировавшей по отдельным локусам в пределах от 55,8 до 89,5%, обнаружено не было.

К настоящему времени опубликованы результаты 7 исследований, направленных на поиск ОРД у спонтанных абортусов (Henderson et al., 1994; Shaffer et al., 1994; Smith et al., 1998; Евдокимова, Назаренко, 2000; Fritz et al., 2001; Kondo et al., 2004; Tsukishiro et al., 2005). При обследовании в общей сложности 392 эмбрионов, с учетом настоящей работы, было найдено 7 абортусов с ОРД: по одному случаю ОРД по хромосомам 7 и 9, три случая ОРД по хромосоме 21, из которых у одного эмбриона ОРД сочеталась с двойной трисомией по хромосомам и 9. У одного зародыша была выявлена сегментная ОРД хромосомы 14. Еще один эмбрион имел сегментную ОРД хромосомы 16. Во всех случаях ОРД имела материнское происхождение, что указывает на ведущую роль хромосомного нерасхождения в мейозе у матери в формировании первично анеуплоидных зигот.

В целом, проанализировано 6156 событий наследования хромосом, из которых найдено только 6 случаев ОРД, не сочетающейся с другими типами хромосомных аномалий. Таким образом, частота формирования ОРД составила 1:1000 со бытий наследования хромосом и оказалась сопоставимой с ожидаемой частотой (1,65:1000), рассчитанной на основании данных о хромосомном нерасхождении в мейозе (Engel, DeLozier-Blanchet, 1991). Вместе с тем, только лишь 2 случая (ОРД хромосомы 7 и сегментная ОРД хромосомы 14) могут рассматриваться в качестве доказательства возможной ассоциации нарушений дозы импринтированных генов с ранней эмбриональной гибелью. Что касается хромосом 9, 16 и 21, то до настоящего времени отсутствует информация о локализации в них импринтированных генов. Таким образом, частота абортусов с вариантами ОРД, затрагивающими непосредственно импринтированные гены, составляет только 0,5% (2/392). Более того, в части исследований (Henderson et al., 1994; Shaffer et al, 1994) поиск ОРД проводился без предварительного цитогенетического анализа, что не исключает попадания в обследованные выборки эмбрионов с хромосомными нарушениями и еще более снижает полученную оценку вклада однородительского наследования хромосом в раннюю эмбриолетальность.

Необходимо отметить, что ОРД является только лишь одним из механизмов, нарушающих дозу импринтированных генов. Поэтому решение вопроса о вкладе мутаций импринтированных локусов генома в нарушение эмбрионального развития человека, решаемое до настоящего времени через поиск ОРД, не должно ограничиваться анализом этого редкого, с цитогенетической точки зрения, феномена. Действительно, образование ОРД зависит от целого ряда мутационных событий, связанных с последовательными нарушениями сегрегации хромосом в мейозе и при последующих митотических делениях эмбриональных клеток. Тот факт, что геномный импринтинг является эпигенетическим феноменом и его молекулярные основы связаны с дифференциальным метилированием регуляторных последовательностей генов позволяет выдвинуть предположение о том, что нарушение экспрессии импринтированных локусов в раннем эмбриогенезе человека может быть связано в большей степени с их эпимутациями, чем с ошибками сегрегации хромосом, ведущими к формированию ОРД. Очевидно, что в отношении затрагиваемого гена эффекты эпимутаций будут функционально эквивалентны однородительскому наследованию хромосом, содержащих импринтированные гены. Эпимутации импринтированных локусов были описаны при биродительском полном пузырном заносе (Van den Veyver, Al-Hussaini, 2006), онкологических заболеваниях (Plass, Soloway, 2002), у пациентов с болезнями геномного импринтинга (синдромы Видемана-Беквита, Энгельмана, Рассела-Сильвера), в том числе и у детей с данными заболеваниями, родившихся в результате применения методов искусственного оплодотворения (Cox et al., 2002;

DeBaun et al., 2003; Kagami et al., 2007). Однако разнообразие и закономерности возникновения аберрантных эпигенетических модификаций импринтированных генов при нарушениях эмбрионального развития остаются неизвестными.

В настоящем исследовании была предложена классификация эпимутаций импринтированных генов. В основу систематизации было положено 3 критерия.

Так, предложено выделять эпимутации, затрагивающие все или отдельные импринтированные локусы генома, а также центры импринтинга. Следующим критерием явилось происхождение эпимутаций, которое может быть связано либо с нарушениями установления импринтинга в гаметогенезе родителей, либо с потерей устойчивости импринтированных локусов к волне эпигенетического репрограммирования генома в соматических клетках эмбриона на самых ранних этапах развития (рис. 1). Соответственно, было предложено выделять гамети- Рис. 1. Динамика эпигенетического репрограммирования генома.

- материнский и отцовский геномы;

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 7 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.