WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |

4. Индукция хромосомного нерасхождения в клетках эмбрионов с нормальным кариотипом ассоциирована с аберрантным метилированием промоторных регионов генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла. Возникновение эпимутаций приходится на преимплантационный период развития и связано с нарушением деметилирования родительских геномов при их эпигенетическом репрограммировании.

5. Аномальное метилирование генов контроля клеточного цикла на постимплантационных этапах развития сопровождает коррекцию анеуплоидии мейотического происхождения с возникновением хромосомного мозаицизма.

6. Мутационный процесс в тетрануклеотидных повторяющихся последовательностях ДНК в половых клетках родителей не оказывает заметного влияния на нарушение эмбрионального развития потомства, тогда как в клетках внутриутробно погибших эмбрионов с нормальным хромосомным набором обнаруживаются мутации микросателлитных последовательностей ДНК постзиготического происхождения.

7. Контаминация культур эмбриональных фибробластов клетками материнского организма оказывает влияние на частоту регистрируемых аномалий кариотипа и на величину показателя «соотношение полов» в группе внутриутробно погибших эмбрионов с нормальным хромосомным набором.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены в форме устных докладов на 3 Европейской конференции по количественной молекулярной цитогенетике (Стокгольм, 2002); 38 конференции Европейского общества генетики человека (Амстердам, 2006); 22-24 Ежегодных конференциях Европейского общества репродукции человека и эмбриологии (Прага, 2006; Лион, 2007; Барселона, 2008); конференциях Фонда Марии Кюри «Молекулярное профилирование генома» (Амстердам, 2007) и «Взаимодействие генетики, эпигенетики и некодирующих РНК» (Мадрид, 2008); III Международной конференции «Проблемы вида и видообразования» (Томск, 2004); XV Международной конференции Российской ассоциации репродукции человека «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Чебоксары, 2005); Международной конференции «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2007); Международной молодежной научнометодической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007); VII и VIII научных конференциях ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН «Генетика человека и патология» (Томск, 2004; 2007); IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Международной научно-практической конференции «Иммунологические аспекты репродукции человека» (Новосибирск, 2008); научно-практических конференциях «Молекулярно-биологические диагностические технологии в практическом здравоохранении» (Новосибирск, 2002); «Клинические аспекты использования молекулярно-биологической диагностики в медицине» (Новосибирск, 2003); «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний:

возможности и перспективы» (Москва, 2006); «Молекулярная генетика наследственных заболеваний и нарушений репродукции» (Новосибирск, 2008); школесеминаре «Актуальные вопросы цитогенетики» (Москва, 2007). Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседаниях Президиума Томского научного центра СО РАМН (Томск, 2005) и Президиума СО РАМН (Новосибирск, 2007), а также на межлабораторных семинарах в ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (Томск, 2008) и в Институте цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 2008).

Публикации. По теме исследования опубликовано 62 работы, в том числе статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 372 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования с обсуждением, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Библиографический указатель включает 569 источников, из них 81 – публикации в отечественной литературе, 488 – в зарубежной печати. Диссертация иллюстрирована 36 рисунками и содержит таблицы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектом настоящего исследования явились группы спонтанно абортированных эмбрионов человека, медицинских абортусов первого триместра беременности, супружеские пары с невынашиванием беременности, а также семьи с нормальной репродуктивной функцией, имеющие живорожденных детей. Проведение исследования было одобрено Комитетом по биомедицинской этике ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (протокол № 7 от 31.03.2006).

Для работы были использованы внезародышевые ткани 1986 спонтанных абортусов, полученные после оперативного или самопроизвольного прерывания беременности от женщин с диагнозами анэмбриония, неразвивающаяся беременность или собственно спонтанный аборт. Ультразвуковая диагностика нарушений внутриутробного развития проводилась в Генетической клинике ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН. Плацентарные ткани медицинских абортусов были получены от женщин, отказавшихся сохранить нормально протекавшую беременность.

Фрагменты плодных оболочек были введены в культуры с целью получения препаратов метафазных хромосом. Образцы экстраэмбриональной мезодермы (ЭМ) и цитотрофобласта хориона (ЦХ) от каждого эмбриона хранились при -70°С для проведения последующих молекулярно-генетических и молекулярноцитогенетических исследований, а также для анализа статуса метилирования ДНК. Выбор данных тканей для проведения исследования был обусловлен их происхождением из производных различных эмбриональных и внезародышевых листков (ЭМ – производная эпибласта, дифференцирующегося из внутренней клеточной массы бластоцисты; ЦХ – производное трофэктодермы), что позволило определить механизмы и стадии возникновения мозаичных хромосомных аномалий и нарушений характера метилирования ДНК в изученных локусах.

Ретроспективный анализ частоты тетраплоидных клеток у эмбрионов с тетраплоидным кариотипом в чистой или мозаичной форме, установленным в ходе цитогенетического исследования, был проведен с помощью двухцветной флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) на интерфазных ядрах некультивированных клеток с центромероспецифичными ДНК-зондами D11Z1 и D17Z1. Присутствие тетраплоидного клона подтверждали, если его частота статистически значимо превышала верхнюю границу доверительного интервала предела обнаружения мутации при интерфазном FISH-анализе. Определение предела и его доверительного интервала проводили при обследовании некультивированных тканей контрольной группы 12 медицинских абортусов с нормальным кариотипом в соответствии с формулами, предложенными Ломакс с соавторами (Lomax et al., 1994). Средняя продолжительность внутриутробного развития зародышей в анализируемой и контрольной группе не имела статистически значимых отличий.

Для исследования эффектов контаминации культур клетками материнского организма был проведен анализ содержания последовательностей ДНК Yхромосомы у 112 эмбрионов с кариотипом 46,ХХ, установленным в ходе культивирования клеток. Анализ был выполнен с использованием образцов ДНК, выделенных из некультивированных тканей зародышей, с помощью ПЦР с праймерами на гомологичный локус хромосом X и Y – ген амелогенина AMELX (Xp22.3)/AMELY (Yp11.2) (Sullivan et al., 1993). Для регистрации возможных числовых нарушений хромосом, невыявленных у 60 эмбрионов вследствие контаминации, использовался анализ наследования 16 полиморфных тетрануклеотидных ДНК-маркеров, локализованных на хромосомах 2, 11, 16, 19, 20 и 21.

Анализ однородительского наследования хромосом был проведен в семьях, имевших спонтанный аборт с нормальным кариотипом. Исследование выполняли с помощью анализа сегрегации 25 полиморфных тетрануклеотидных ДНК-маркеров, локализованных на хромосомах 2, 9, 11, 15, 16, 19, 20 и 21. Критериями отбора хромосом являлись: локализация в них импринтированных генов, участвующих в регуляции роста и развития плода и плаценты; наличие ортологичных с хромосомами мыши участков, ОРД по которым ведет к ранней эмбриональной гибели животных; отсутствие ОРД по исследуемой хромосоме у живорожденных индивидов; регистрация ОРД у спонтанных абортусов в других исследованиях; частое вовлечение хромосомы в мейотическое нерасхождение, увеличивающее риск формирования ОРД.

Поиск эпимутаций импринтированных локусов (SNURF-SNRPN, H19, KCNQ1OT1, CDKN1C) осуществляли у 84 спонтанных абортусов с нарушениями клеточной пролиферации: 30 эмбрионов имели морфологически определяемую гиперплазию ворсин трофобласта, у 54 зародышей клетки оказались неспособными к нормальной пролиферации в культуре. В качестве контрольной группы были обследованы экстраэмбриональные ткани 24 медицинских абортусов.

Средний возраст родителей и продолжительность внутриутробного развития эмбрионов в сравниваемых группах не имели статистически значимых отличий.

После бисульфитной конверсии геномной ДНК была проведена метилспецифичная ПЦР локусов SNURF-SNRPN, H19, CDKN1C с использованием праймеров, предложенных в работах Kubota et al., 1997, Poon et al., 2002, Li et al., 2002. Исследование метилирования центра импринтинга KCNQ1OT1 было выполнено с помощью метилчувствительной ПЦР после обработки геномной ДНК метилчувствительной эндонуклеазой NotI в течение 16 час при 37°С (Engel et al., 2000).

Анализ гаметических мутаций 15 микросателлитных последовательностей ДНК, локализованных на хромосомах 2, 9, 11, 16, 17, 19 и 21, был проведен в супружеских парах, имевших спонтанный аборт с нормальным кариотипом. В качестве контрольной группы обследовано 95 семей с нормальной репродуктивной функцией (мать, отец, ребенок). Средний возраст родителей в семьях с невынашиванием беременности и в контрольной выборке на момент рождения ребенка статистически значимо не отличался. Критерием регистрации мутации гаметического происхождения являлось наличие у потомка аллеля, несовпадающего по своему размеру ни с одним из родительских аллелей исследуемого локуса.

При этом вероятность биологического родства определялась при анализе насле дования аллелей как минимум 10 других информативных микросателлитных локусов и составляла во всех случаях не менее 99,99%.

Анализ соматических мутаций был проведен через исследование сегрегации аллелей 10 микросателлитных локусов в 95 семьях с невынашиванием беременности, а также в контрольной группе, представленной 51 медицинским абортусом и 102 родителями. Продолжительность развития эмбрионов и средний возраст родителей в сравниваемых группах не имели значимых отличий. Наличие соматической мутации в исследуемом локусе предполагалось в случае выявления у зародыша с нормальным кариотипом дополнительного третьего аллеля, отличающегося по размеру от двух других аллелей, наследованных от родителей. Присутствие мутации принималось после исключения с помощью интерфазного FISH-анализа триплоидии или трисомии, невыявленных вследствие контаминации культур клетками матери или хромосомного мозаицизма. Критериями отбора ДНК-маркеров для анализа мутаций являлись: тетрануклеотидная повторяющаяся последовательность; гетерозиготность не менее 0,70; размер продуктов амплификации не более 300 п.н. Информация о локализации ДНКмаркеров в геноме, последовательностях праймеров и условиях амплификации была получена из баз данных: www.genome.ucsc.edu и www.gdb.org. Частоты аллелей и генотипов, а также их соответствие ожидаемому распределению при равновесии Харди-Вайнберга вычисляли с помощью программы «RC», основанной на алгоритме, предложенном Рольфом и Бентзеном (Rolf, Bentzen, 1989).

Сравнение частот мутаций проводили с использованием -критерия Фишера для значений частот, близких к нулю (Лакин, 1973).

Изучение частоты и межтканевого распределения анеуплоидных клеток у 39 эмбрионов с аномальным кариотипом, установленным в ходе цитогенетического исследования, проводили в некультивированных тканях с помощью интерфазной FISH с центромероспецифичными ДНК-зондами на соответствующие хромосомы. Исследуемая выборка была дополнена 11 спонтанными абортусами из архивного материала лаборатории цитогенетики, мозаичный кариотип которых был установлен с помощью интерфазной FISH с центромероспецифичными ДНК-зондами на все хромосомы набора. Анализ достоверности межтканевых различий по частотам анеуплоидных клеток проводили с помощью критерия 2.

Исследование статуса метилирования генов контроля клеточного цикла (RB1, CDKN2A, CDKN2B, P14ARF) было выполнено в экстраэмбриональных тканях 50 спонтанных абортусов с хромосомным мозаицизмом, 20 спонтанных абортусов с нормальным кариотипом и 23 медицинских абортусов. Средняя продолжительность развития эмбрионов в исследованных группах не отличалась. Метилспецифичную ПЦР проводили с использованием праймеров и условий, предложенных в работах Herman et al., 1996, Esteller et al., 2001, GonzalezGomez et al., 2003. В гене CDKN2A характер метилирования был определен в экзоне I с помощью метилспецифичной и метилчувствительной ПЦР (Herman et al., 1996; Xing et al., 1999), а также в промоторе с помощью метилчувствительной ПЦР (Землякова с соавт., 2004), при этом объем контрольной выборки был увеличен до 36 эмбрионов. Частоту эпимутаций определяли как отношение числа метилированных аллелей к общему числу проанализированных последовательностей исследуемого локуса.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Цитогенетическое исследование спонтанных абортусов человека Первым этапом работы явился цитогенетический анализ внутриутробно погибших эмбрионов с целью выделения групп зародышей с нормальным кариотипом и с хромосомными аномалиями для проведения дальнейших разделов исследования. Успешное культивирование клеток и стандартный метафазный анализ выполнены для 717 из 1986 спонтанных абортусов, клетки которых были введены в культуры. Нормальный хромосомный набор определен у 42,9% эмбрионов: 116 зародышей имели кариотип 46,XY, а 191 – 46,XX. Нормальное число хромосом было определено также у 19 из 47 спонтанных абортусов с пузырным заносом, что составило 2,6% от общего объема выборки.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.