WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВ Игорь Николаевич ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА В ЭМБРИОНАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ ОНТОГЕНЕЗА ЧЕЛОВЕКА 03.00.15 – генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск 2008 Диссертация выполнена в лаборатории цитогенетики Государственного учреждения Научно-исследовательский институт медицинской генетики Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Научные консультанты: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Пузырёв Валерий Павлович член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Назаренко Сергей Андреевич

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, Воевода Михаил Иванович доктор биологических наук, профессор Рубцов Николай Борисович доктор биологических наук, профессор Стегний Владимир Николаевич

Ведущая организация: ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, г. Москва

Защита диссертации состоится “ ” 2008 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д-003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.

тел. (383)333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан “” _ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук А.Д. Груздев 2 1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Для нормального индивидуального развития и реализации генетической программы онтогенеза существенное значение имеет эпигенетическая регуляция активности генов, обеспечивающая установление и поддержание их дифференциальной экспрессии (Holliday, 1991; Голубовский, 2000; Li, 2002;

Jablonka, Lamb, 2005; Чураев, 2006). Согласно современным представлениям, под эпигенетическими процессами понимают наследуемые, стабильные, но потенциально обратимые изменения экспрессии генов, не связанные с нарушениями их нуклеотидной последовательности (Russo et al., 1996; Bird, 2002; Ванюшин, 2006). Молекулярной основой эпигенетических феноменов являются ковалентные модификации структуры хроматина, представленные метилированием ДНК и модификациями гистоновых белков. Подобные изменения ответственны за осуществление таких генетических процессов как дифференциальная экспрессия генов, геномный импринтинг, инактивация Х-хромосомы, репрессия мобильных генетических элементов (Robertson, Wolfe, 2000; Costello, Plass, 2001).

Нарушение этих процессов через повреждение эпигенетических механизмов приводит к аномалиям развития организма человека, проявляющимся в виде особого класса патологии, который предложено называть эпигенетическими болезнями (Beaudet, 2002). Примерами таких заболеваний являются болезни геномного импринтинга (Hall, 1990; Баранов, 1991; Пузырёв, 1995; Reik, Walter, 2001), хроматиновые болезни (Johnson, 2000; Hendrich, Bickmore, 2001; Назаренко, 2004; Santos-Rebouas, Pimentel, 2007). Значительным является вклад аберрантных эпигенетических модификаций генома в развитие злокачественных новообразований (Feinberg et al., 2002; Немцова, Залетаев, 2004; Киселёва, Киселёв, 2005). Обсуждается роль эпигенетических нарушений и в этиологии мультифакториальных заболеваний (Petronis, 2001; Pembrey, 2002; Whitelaw, 2006).

Интенсивно накапливающаяся информация о патогенетической значимости аберрантных эпигенетических модификаций обусловливает актуальность исследований, направленных на изучение молекулярных и онтогенетических механизмов возникновения эпимутаций (Holliday, 1987, 1991; Horsthemke, 2006). Показано, что особенностью ранних этапов онтогенеза млекопитающих является тотальное эпигенетическое репрограммирование генома, заключающееся в закономерном чередовании волн деметилирования и реметилирования ДНК в половых клетках и на начальных стадиях развития зародыша (Li, 2002; Dean et al., 2003; Sasaki, Matsui, 2008). Эпигенетическое репрограммирование обеспечивает удаление аберрантных эпигенотипов, последовательную индукцию тотипотентности и дифференциальной экспрессии генов. Нарушения этих процессов могут вести к формированию аберрантных эпигенотипов, обусловливающих установление и долговременное поддержание аномальных профилей генной экспрессии, приводящих к патологии развития организма (Dolinoy et al., 2007; Gicquel et al., 2008). Однако до сих пор остается неустановленным вклад аномальных эпигенетических модификаций генома в нарушение эмбрионального периода онтогенеза, который у человека характеризуется высокой частотой репродуктивных потерь – около 60% зигот элиминируется на пре- и ранних постимплантационных этапах развития, а 15-20% клинически распознаваемых беременностей спонтанно прерывается в течение первого триместра (Macklon et al., 2002). Доминирующим фактором, обусловливающим раннюю остановку эмбрионального развития у человека, являются геномные мутации, представленные в основном числовыми нарушениями хромосом (Назаренко, 1993; Griffin, 1996; Hassold, Hunt, 2001; Баранов, Кузнецова, 2007). Что касается внутриутробно погибших эмбрионов с нормальным кариотипом, то генетические причины прекращения их развития остаются, как правило, неустановленными.

Одной из групп генов, в обеспечении функций которых существенная роль отводится эпигенетическим механизмам, являются импринтированные гены. Их моноаллельная экспрессия определяется родительским происхождением активного аллеля и связана с дифференциальным метилированием регуляторных последовательностей, формирующимся строго специфичным образом в гаметогенезе (Reik, Walter, 2001; Solter, 2006; Trasler, 2006). Нарушение функций импринтированных генов, большинство из которых вовлечены в регуляцию дифференцировки плацентарных и плодных тканей, рассматривается как весомый фактор нарушений внутриутробного развития млекопитающих (Tycko, 2006). В экспериментах на мышах было показано, что однородительские дисомии хромосом (ОРД), содержащих импринтированные локусы, как правило, несовместимы с нормальным прохождением эмбрионального развития (Cattanach, Jones, 1994).

В то же время попытки найти ОРД у внутриутробно погибших эмбрионов человека пока не увенчались заметным успехом (Fritz et al., 2001; Kondo et al., 2004;

Tsukishiro et al., 2005). Учитывая эпигенетический характер регуляции экспрессии импринтированных генов можно предположить, что ожидаемый негативный эффект нарушений их дозы в эмбриональном периоде онтогенеза человека будет связан не только с формированием ОРД, но и с эпимутациями – аномалиями дифференциального метилирования регуляторных областей. Для изучения разнообразия и эффектов эпимутаций возникает необходимость в их систематизации, учитывающей стадии онтогенеза, на которых возможно возникновение нарушений метилирования, спектр функционально значимых эпигенетических модификаций, а также число затрагиваемых импринтированных локусов генома.

Следующим аспектом действия аберрантных эпигенетических процессов может оказаться возрастание частоты мутаций. Этот эффект наиболее изучен при злокачественной трансформации клеток, при которой глобальное деметилирование генома, с одной стороны, и аномальное метилирование промоторов генов репарации ДНК, регуляции клеточного цикла, апоптоза, с другой стороны, сопровождают появление микросателлитной и хромосомной нестабильности (Costello, Plass, 2001; Feinberg, 2001; Geigl, 2008). Что касается эмбрионального периода развития, то имеются сообщения о повышенной частоте мутаций микросателлитных последовательностей ДНК в клетках погибших эмбрионов (Kiaris et al., 1996; Spandidos et al., 1998), а также данные о высоком уровне хромосомного мозаицизма при нарушениях пре- и постимплантационных стадий онтогенеза (Harper et al., 1995; Griffin et al., 1997; Delhanty, 2005; Vorsanova et al., 2005).

Наличие высокой частоты мозаичных кариотипов свидетельствует о том, что наряду с ошибками мейотической сегрегации хромосом, существенную роль в возникновении летальных геномных мутаций могут играть и нарушения митотического распределения хромосом в соматических клетках зародыша. Однако цитогенетические и молекулярные механизмы индукции хромосомного нерасхождения и, как следствие, возникновения мозаицизма в эмбриональном периоде онтогенеза остаются неясными.

Отмечено, что максимальное накопление мозаичных нарушений кариотипа приходится на этап дробления бластомеров (Los et al., 2004), причем эта особен ность характерна и для других изученных видов млекопитающих (Shi et al., 2004). Поскольку преимплантационный период развития характеризуется интенсивной эпигенетической реорганизацией генома, то не исключено, что нарушения этого процесса могут приводить к формированию аберрантных профилей экспрессии генов, ответственных за поддержание геномной стабильности, а также тех локусов, функционирование которых является принципиально важным для обеспечения нормального эмбрионального развития организма.

Цель исследования заключалась в установлении вклада аномалий эпигенетической регуляции активности генов в нарушение эмбрионального развития человека.

Задачи исследования:

1. Установить спектр и частоту хромосомных аномалий при эмбриональной гибели у человека и разработать подходы к оценке факторов, оказывающих влияние на достоверность регистрации цитогенетических показателей при анализе репродуктивных потерь.

2. Оценить вклад однородительского наследования хромосом во внутриутробную гибель эмбрионов с нормальным кариотипом.

3. Обосновать подходы к систематизации эпимутаций импринтированных генов и предложить их классификацию.

4. Определить роль эпимутаций импринтированных локусов генома в нарушении эмбрионального развития человека.

5. Провести сравнительный анализ частоты гаметических мутаций микросателлитных последовательностей ДНК в семьях с нормальной репродуктивной функцией и в супружеских парах с невынашиванием беременности.

6. Оценить частоту соматических мутаций микросателлитных повторов ДНК при нарушениях эмбрионального развития.

7. Изучить цитогенетические механизмы возникновения мозаичных форм нарушений кариотипа при ранней эмбриональной гибели.

8. Определить роль эпигенетической инактивации генов контроля клеточного цикла в формировании хромосомного мозаицизма при нарушении внутриутробного развития.

Научная новизна работы. Основным научным результатом исследования явилось определение роли аберрантных эпигенетических модификаций генома в детерминации нарушений эмбрионального развития человека. Получены новые данные об эпигенетических механизмах, изменяющих дозу импринтированных генов при патологии внутриутробного периода онтогенеза. Впервые показано, что нарушения геномного импринтинга связаны с аномалиями поддержания дифференциального метилирования импринтированных генов в соматических клетках эмбрионов на постимплантационных этапах развития. Предложена классификация эпимутаций импринтированных локусов в геноме человека.

Продемонстрировано увеличение мутационной изменчивости генома соматических клеток при внутриутробной гибели эмбрионов, проявляющейся в форме мутаций микросателлитных последовательностей ДНК, а также мозаичных вариантов нарушений кариотипа. Впервые исследован вопрос о связи аномального метилирования генов контроля клеточного цикла с возникновением хромосомного мозаицизма в эмбриональных клетках. Установлено, что нарушения эпигенетического репрограммирования генома зигот с нормальным хромосомным набором ведут к формированию аберрантных эпигенотипов, ассоциированных с тканеспецифичным хромосомным мозаицизмом, тогда как у эмбрионов, развивающихся из зигот с анеуплоидным кариотипом, эпигенетическая инактивация исследованных генов клеточного цикла может сопровождать коррекцию анеуплоидии и также приводить к возникновению хромосомного мозаицизма.

Обоснованы теоретические подходы к анализу цитогенетических механизмов формирования мозаичных вариантов хромосомного набора в эмбриональном периоде онтогенеза, основанные на учете закономерностей возникновения и распределения клеток с числовыми нарушениями хромосом в производных различных зародышевых листков.

Практическая значимость работы. В ходе выполнения исследования проведена оценка факторов, оказывающих влияние на достоверность цитогенетического анализа хромосомных нарушений в клетках внутриутробно погибших эмбрионов человека. Предложен подход к оценке уровня полиплоидизации эмбриональных фибробластов при длительном культивировании in vitro. Разработана математическая модель оценки эффектов контаминации культур клетками материнского организма. С её использованием становится возможной коррекция частоты регистрируемых хромосомных нарушений и показателя «соотношение полов» у эмбрионов с нормальным кариотипом при проведении цитогенетического анализа. Предложенная модель может быть использована в качестве одного из элементов контроля качества лабораторных цитогенетических исследований.

Разработанные подходы к анализу механизмов формирования хромосомного мозаицизма могут представлять ценность для оценки риска таких клинически значимых феноменов в репродукции человека, как ограниченный плацентарный мозаицизм, гонадный мозаицизм, однородительские дисомии хромосом. Результаты исследования могут способствовать повышению эффективности медикогенетического консультирования супружеских пар с невынашиванием беременности. Полученные данные представляют интерес для специалистов в области цитогенетики, генетики развития, молекулярной генетики, пренатальной и преимплантационной генетической диагностики, акушерства и гинекологии. Материалы исследования используются в курсах лекций для студентов биологических и медицинских специальностей ВУЗов, а также в циклах постдипломной подготовки специалистов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Предложена классификация эпимутаций импринтированных генов, учитывающая стадии онтогенеза, на которых возможно возникновение нарушений метилирования, спектр функционально значимых эпигенетических модификаций, а также число затрагиваемых импринтированных локусов.

2. Нарушение функций импринтированных генов при патологии эмбрионального развития человека связано с изменениями дифференциального характера метилирования их регуляторных областей. Возникновение эпимутаций обусловлено аномалиями поддержания геномного импринтинга в соматических клетках эмбрионов на постимплантационных этапах онтогенеза.

3. Однородительская дисомия хромосом 2, 9, 11, 15, 16, 19, 20 и 21 не вносит заметного вклада во внутриутробную гибель эмбрионов человека с нормальным хромосомным набором.

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |



© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.