WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

а б начало элюции 010 20 N фракции Рис. 10. Фракционирование диффузатов оболочки пыльцевого зерна методом аффинной хроматографии на колонке с ММП-Агарозой (а) и электрофоретический анализ маннозо-специфичных лектинов (б).

Дорожка 1 диффузаты; дорожка 2 фракция лектинов (№ 32).

Справа указаны рассчитанные молекулярные массы лектинов (кДа).

Слева положение белков-маркеров (кДа).

Влияние маннозо-специфичных лектинов на прорастание пыльцевого зерна Маннозо-специфичные лектины стимулировали прорастание пыльцы (Рис. 11 а). Как и нефракционированные диффузаты, они оказывали двухфазное действие на этот процесс. Однако концентрация белка, оптимальная для стимулирования прорастания, для диффузатов была в 100 раз больше, чем для Концентарция белка, мкг/мл маннозо-специфичных лектинов (26 и 0,2 мкг белка/мл, соответственно) (Рис. 4 и 11 а). Эти лектины выступали как эффективный стимулирующий агент, увеличивая прорастание до 49 %, что сопоставимо с уровнем прорастания в культуре с высокой концентрацией клеток (62 %).

а б 0 0.5 1 1.5 2 2.контроль лектин лектин + ММП Концентрация белка, мкг/мл Рис. 11. Влияние маннозо-специфичных лектинов на прорастание пыльцевых зёрен в тест-культуре (а) и подавление эффекта лектинов в присутствии ММП (0,3 М) (б).

В экспериментах с предварительной инкубацией маннозо-специфичных лектинов (0,2 мкг/мл) в присутствии 0,3 М ММП было обнаружено блокирование их стимулирующего действия на прорастание пыльцы (Рис. 11 б). Это позволяет сделать вывод о том, что способность выделенных маннозо-специфичных лектинов стимулировать прорастание определяется их специфическим взаимодействием с соответствующими углеводными детерминантами, локализованными предположительно на поверхности плазмалеммы.

Механизм действия обнаруженных лектинов на активацию и прорастание пыльцы нуждается в дальнейшем изучении. Можно предположить, что взаимодействие подвижных лектинов оболочки пыльцевого зерна с плазмалеммой его вегетативной клетки модулирует работу ион-транспортирующих белков плазмалеммы или запускает сигнальные каскады, подобно тому, как это происходит в клетках животных (Hsu et al., 2009; Garner, Baum, 2008).

Прорастание, % Прорастание, % ЗАКЛЮЧЕНИЕ Более 100 лет прошло с момента открытия в семенах бобовых белков, способных агглютинировать эритроциты (Sharon, Lis, 2004). В настоящее время, в основном, благодаря исследованиям лектинов животных, представления об их функциональной значимости существенно расширились. Стала очевидной их роль в распознавании углеводных сигналов как эндогенной, так и экзогенной природы (Gabius et al., 2008). Однако роль белок-углеводных взаимодействий в физиологических процессах у растений по-прежнему остается мало изученной (De Hoff, 2009).

В настоящей работе установлено участие эндогенных лектинов в регуляции ключевого этапа жизни мужского гаметофита его прорастания. Участие белокуглеводных взаимодействий в данном процессе ранее было показано с помощью экзогенных лектинов (Southworth, 1975; Knox et al., 1976). Эти представления были дополнены в настоящей работе. Установлено, что лектин Кон А специфически взаимодействует с углеводными детерминантами плазмалеммы вегетативной клетки пыльцевого зерна и вызывает её гиперполяризацию и увеличение внутриклеточного рН. Вследствие этого возрастает эффективность прорастания пыльцы.

Нами впервые обнаружены эндогенные лектины, диффундирующие из оболочки пыльцевого зерна в процессе его гидратации. Эти лектины сходны с Кон А по углеводной специфичности и аналогичным образом действуют на мембранный потенциал вегетативной клетки и прорастание пыльцы. Показано, что эти эффекты обусловлены специфическим взаимодействием лектинов с углеводными детерминантами, по-видимому, теми же, с которыми взаимодействует Кон А.

В данной работе впервые представлены результаты, свидетельствующие об участии лектинов в реализации популяционного эффекта, который оказывает существенное влияние на прорастание пыльцы в условиях in vivo и in vitro.

Известно, что этот эффект играет важную роль и в поведении культур соматических клеток растений (Vasil, 2008). В этой связи заслуживает рассмотрения вопрос об универсальности механизмов регуляции ростовых процессов, использующих лектины.

ВЫВОДЫ 1. Исследовано стимулирующее действие экзогенного лектина конканавалина А на активацию и прорастание пыльцы табака in vitro. Методами флуоресцентной микроскопии установлено, что на начальном этапе активации пыльцевого зерна этот лектин вызывает увеличение внутриклеточного рН и гиперполяризацию плазмалеммы его вегетативной клетки. Выявлена взаимосвязь между действием конканавалина А на величину мембранного потенциала этой клетки и эффективностью прорастания пыльцевых зёрен. Все указанные эффекты конканавалина А полностью блокировал конкурентный сахар метил--Dманнопиранозид, что свидетельствует о специфическом взаимодействии данного лектина с углеводными детерминантами, предположительно гликоконъюгатами плазмалеммы.

2. Исследовано действие веществ оболочки пыльцевого зерна, легковымываемых в водной среде, на суспензионные культуры пыльцевых зёрен, в которых эффективность прорастания существенно снижена вследствие уменьшения концентрации клеток в суспензии. Установлено, что легковымываемые вещества оболочки восстанавливают способность пыльцы к прорастанию. Эффект этих диффузатов проявлялся также в гиперполяризации плазмалеммы вегетативной клетки пыльцевого зерна на начальном этапе его активации. В результате очистки на сефадексе выделена смесь белков 64, 58, 51, 50 и 35 кДа, аналогичным образом действующая на активацию и прорастание пыльцы, а методом гемагглютинации подтверждено присутствие в указанной смеси белков лектинов.

3. Методом аффинной хроматографии выделены в виде единичного пика маннозоспецифичные лектины, легковымываемые из оболочки пыльцевого зерна.

По данным электрофоретического анализа, молекулярные массы этих белков составляли 58, 69 и 74 кДа. Эта фракция стимулировала прорастание в культурах с низкой концентрацией клеток. Показано, что данный эффект обусловлен специфическим взаимодействием лектинов с углеводными детерминантами.

4. Полученные результаты впервые выявили участие углеводных детерминант плазмалеммы вегетативной клетки пыльцевого зерна и эндогенных лектинов его оболочки в регуляции ростовой функции. Эти лектины диффундируют в окружающую среду в процессе гидратации пыльцевых зёрен и могут опосредовать их взаимодействия между собой и с клетками рыльца.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ I. Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации соискателей учёной степени кандидата наук 1. Матвеева Н.П., Андреюк Д.С., Лазарева Е.А., Ермаков И.П. Влияние конканавалина А на величину мембранного потенциала и внутриклеточный рН в процессе активации пыльцевого зерна табака in vitro // Физиология растений.

2004. Т. 51. № 4. стр. 549–554.

2. Матвеева Н.П., Лазарева Е.А., Клюшник Т.П., Зозуля С.А.,Ермаков И.П.

Выявление лектинов оболочки пыльцевого зерна Nicotiana tabacum L, стимулирующих прорастание in vitro // Физиология растений. 2007. Т. 54. № 5.

стр. 699–706.

II. Прочие публикации 3. Лазарева Е.А. Флуориметрическое изучение изменений мембранного потенциала на начальном этапе прорастания пыльцевого зерна табака // Материалы X междунар. конф студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2003», 15-18 апреля 2003 г., Москва, стр. 27–28.

4. Лазарева Е.А. Измерение величины мембранного потенциала вегетативной клетки пыльцевого зерна // V Съезд общества физиологов растений России, Тезисы докладов Междунар. конф. «Физиология растений – основа фитобиотехологии», Пенза, 15-21 сентября 2003 г., стр. 121.

5. Лазарева Е.А. Роль внеклеточных лектинов в регуляции прорастания пыльцевого зерна табака // Тезисы докладов XI междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2004», 12-15 апреля 2004 г., Москва, стр. 83.

6. Лазарева Е.А., Матвеева Н.П., Ермаков И.П. Лектины оболочек пыльцевого зерна табака // Материалы IV междунар. научной конф. «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» г. Минск, 26-28 октября 2005 г., стр. 132133.

7. Лазарева Е.А. Водорастворимые лектины оболочек пыльцевого зерна табака // Программа и тезисы I Междунар. Школы для Молодых Ученых «Эмбриология и Биотехнология» 4-9 декабря 2005 г., Санкт-Петербург, стр. 44.

8. Лазарева Е.А. Краснолобова С.А. Выявление стимулирующих прорастание лектинов в оболочке пыльцевого зерна табака // Тезисы докладов XIII междунар.

конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», 12-15 апреля 2006 г., Москва, стр. 134-–135.

9. Lazareva E.A., Matveyeva N.P., Yermakov I.P. Pollen wall lectins contribute to germination in vitro // XIXth International Congress on Sexual Plant Reproduction «From gametes to genes» organized by the Agricultural Research Institute of the Hungarian Academy of Sciences under the auspices of the International Association of Sexual Plant Reproduction Research (IASPRR), July 11-15, 2006, Budapest, Hungary, Р. 172–173.

10. Лазарева Е.А., Матвеева Н.П., Ермаков И.П. Участие лектинов оболочки пыльцевого зерна в запуске прорастания // VI Съезд общества физиологов растений России, Тезисы докладов Междунар. конф. «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», 18-24 июня 2007 г., г. Сыктывкар, часть первая, стр. 315–316.

11. Лазарева Е.А., Матвеева Н.П., Ермаков И.П. Лектины оболочек пыльцевого зерна табака и их роль в регуляции прорастания // Тезисы докладов II Междунар.

Школы молодых учёных «Эмбирология, генетика и биотехнология» Уфа, 3-декабря, 2007 г., стр. 80–82.

12. Лазарева Е.А., Филимонова М.В. Роль лектинов оболочки в активации и прорастании пыльцевого зерна табака // Тезисы докладов III Междунар. школы молодых ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология», г. Саратов, 29 июня- 3 июля 2009 г., стр. 66–68.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»