WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

7.7.6.6.Контроль КонА КонА+ММП Рис. 3. Влияние Кон А (100 мкг/мл) на величину внутриклеточного рН вегетативной клетки пыльцевого зерна и подавление эффекта Кон А в присутствии ММП (0,1 М).

Таким образом, проведённые эксперименты показали, что экзогенный глюкозо/маннозо-специфичный лектин Кон А стимулирует активацию и прорастание пыльцевого зерна табака. Эти результаты хорошо соотносятся с данными о том, что Кон А вызывает активацию клеток животных, наиболее ранними проявлениями которой являются гиперполяризация плазмалеммы (Tatham, Delves, 1984) и увеличение внутриклеточного рН (Hesketh et al., 1985).

Рассмотренные результаты демонстрируют участие в запуске прорастания пыльцы гликоконъюгатов плазмалеммы, с которыми могут взаимодействовать лектины экзогенный Кон А или гипотетические эндогенные лектины оболочки. Выявление этих лектинов стало целью нашей дальнейшей работы.

2. Действие диффузатов оболочки на активацию и прорастание пыльцевого зерна Анализ действия диффузатов на тест-культуры с низкой концентрацией пыльцевых зёрен выявил их влияние на прорастание (Рис. 4, 5). В первой серии опытов диффузаты присутствовали в среде на протяжении всего периода инкубации (1 ч) (Рис. 4). При этом был обнаружен выраженный оптимум Внутриклеточный рН количества диффузатов в среде (26 мкг белка/мл), при котором они эффективно стимулировали прорастание. В дальнейшем мы использовали диффузаты в концентрации от 20 до 30 мкг белка/мл. Высокие концентрации диффузатов в среде (100 мкг белка/мл) практически полностью подавляли прорастание.

Таким образом, в составе диффузатов из оболочек пыльцы присутствуют физиологически активные вещества. Предположив, что их действие на прорастание реализуется на начальном этапе активации пыльцевого зерна, мы использовали ранее разработанные в модельных экспериментах с Кон А подходы для проверки этой гипотезы.

0 25 50 75 10 кл./мл 770 кл./мл 770 кл./мл + Диффузаты, мкг белка/мл диффузаты Рис. 4. Влияние диффузатов оболочек на Рис. 5. Действие диффузатов оболочки прорастание пыльцевых зёрен. на прорастание пыльцевых зёрен.

Длительное воздействие диффузатами (1 ч). Кратковременное воздействие диффузатами (10 мин).

Пыльцевые зёрна культивировали с диффузатами (21 мкг белка/мл) в течение 10 мин, после чего их переносили в среду без диффузатов.

Из результатов, представленных на рисунке 5, видно, что такое воздействие на тест-культуру приводило к двукратному увеличению числа проросших пыльцевых зёрен, тем самым достигался уровень прорастания в контроле с высокой концентрацией клеток. Таким образом, и кратковременное (Рис. 5), и длительное (Рис. 4) воздействие диффузатами стимулировало прорастание пыльцевых зёрен в равной мере. Из этого следует, что стимулирующий эффект Прорастание, % Прорастание, % диффузатов на прорастание определяется их действием на ранние стадии активации.

Ранее на пыльце петунии уже наблюдали стимулирующий эффект диффузатов на прорастание пыльцы (Kirby, Vasil, 1979). Полученные нами данные подтверждают эти данные и уточняют время действия диффузатов это ранний этап активации пыльцевого зерна. Вместе с тем, мы можем исключить из рассмотрения белки трифины, поскольку в наших опытах трифина была удалена до начала эксперимента.

Рис. 6. Влияние диффузатов оболочки на величину мембранного потенциала вегетативной клетки пыльцевого зерна.

Для выявления действия диффузатов на величину мембранного потенциала плазмалеммы вегетативной клетки их добавляли в тест-культуру пыльцевых зёрен одновременно с потенциал-зависимым красителем DiВAC4(3). После 10 мин инкубации обнаруживалась гиперполяризация плазмалеммы, степень которой росла с увеличением концентрации диффузатов, достигая –63 мВ при концентрации диффузатов 240 мкг белка/мл (Рис. 6). Стоит отметить, что диффузаты в концентрации более 100 мкг белка/мл практически полностью подавляли прорастание пыльцы (Рис. 4). Для того, чтобы ответить на вопрос, связано ли это с нарушением ионного гомеостаза, действием ингибиторов прорастания, присутствующих в составе диффузатов, или иными причинами, необходимы дополнительные исследования.

Таким образом, нами впервые получены данные, свидетельствующие о наличии в оболочке пыльцевого зерна регуляторных факторов, стимулирующих его активацию. Данные о действии диффузатов на величину мембранного потенциала плазмалеммы вегетативной клетки позволяют предполагать, что они могут напрямую или опосредованно модулировать работу её ион-транспортных белков.

Изменения мембранного потенциала строго контролируются клеткой и определяются активностью ион-транспортных систем плазмалеммы. Экзогенные лектины, в частности Кон А, способны влиять на ионные потоки и вызывать гиперполяризацию плазмалеммы клеток животных (Mahaut-Smith et al., 1991;

Lai et al., 2003; Wang et al., 2006). В основе обусловленной действием Кон А и диффузатами гиперполяризации, возможно, лежат сходные механизмы регуляции, основанные на лектин-углеводных взаимодействиях. Обнаруженное в данной работе сходство эффектов Кон А и диффузатов позволяет предположить наличие в составе диффузатов лектинов, сходных с Кон А по углеводной специфичности и действию на прорастание пыльцы.

3. Выявление лектинов в диффузатах Для выявления лектиновой активности диффузатов использовали общепринятый метод гемагглютинации, в основе которого лежит способность поливалентных лектинов взаимодействовать с гликанами на поверхности эритроцитов млекопитающих, в результате чего происходит их «склеивание».

Оседая на дно U-образной лунки, такие сшитые лектинами клетки формируют диффузное пятно, тогда как в отсутствие лектина клетки собираются в компактную точечную структуру.

Использование этого метода позволило выявить присутствие лектинов в диффузатах (Табл. 1). Эффект постепенно снижался по мере разведения пробы и полностью исчезал при концентрации 50 мкг белка/мл. Способность диффузатов агглютинировать эритроциты позволяет предполагать наличие в их составе поливалентных лектинов (моновалентные лектины не способны к агглютинации) (Gabius et al., 2004).

Агглютинирующую активность, наряду с лектинами, проявляют таннины (в пыльце не обнаружены), некоторые фенолы, липиды и некоторые ионы двухвалентных металлов (Gabius et al., 2004). Для того чтобы выявить возможный вклад в гемагглютинацию низкомолекулярных веществ, диффузаты фракционировали методом ультрафильтрации с порогом разделения 10 кДа.

Было обнаружено, что низкомолекулярная компонента диффузатов не способна к агглютинации.

Табл. 1. Выявление лектиновой активности пыльцевых диффузатов в тесте гемагглютинации и обнаружение в их числе гликопротеинов, образующих комплекс с экзогенным лектином Кон А, неактивный в этом тесте.

Концентрация белка в серии двукратных разведений диффузатов, мкг/мл Анализируемая проба 400 200 100 50 Диффузаты +++ +++ ++ + Диффузаты + +++ +++ ++ + +++ Кон А (5 мкг/мл) +++ максимальная лектиновая активность, отсутствие агглютинации Попытка выявить углеводную специфичность изучаемых лектинов, подобрав сахарид, способный подавить вызванную ими агглютинацию эритроцитов, не дала положительного результата. Мы исследовали действие ММП, глюкозы, арабинозы, галактозы, рамнозы, сахарозы, лактозы, раффинозы, взятых в концентрации 0,1 М, смеси двух сахаров (глюкоза и ММП), а также водорастворимого декстрана (50 мг/мл). Однако ни один из указанных углеводов не подавлял лектиновую активность диффузатов.

Отрицательные результаты определения углеводной специфичности можно объяснить присутствием в диффузатах нескольких лектинов с различной специфичностью или же тем, что эти лектины специфичны к сложным гликанам.

Ранее были обнаружены прочно связанные с оболочками пыльцевого зерна лектины, которые существенно различались по углеводной специфичности.

Некоторые из них специфически взаимодействовали с гликопротеинами (муцином, тиреоглобулином и фетуином) и не проявляли сродства к моно- и дисахаридам (Carrat, Giannattasio, 1990). Другие лектины были специфичны к D-глюкозе и некоторым другим простым сахарам (Ковалева и др., 1999).

Углеводную специфичность лектина, секретируемого пыльцевой трубкой табака, при тестировании моно- и дисахаридов установить не удалось (Ильченко, 1988).

Для последующей идентификации выявленных лектинов, а также для дальнейшей работы с ними важно знать, являются ли они гликопротеинами.

Ответ на этот вопрос был получен в результате изучения взаимодействия диффузатов с Кон А, который прочно связывается гликанами гликопротеинов (Gabius et al., 2004). С этой целью к диффузатам добавляли Кон А и оценивали лектиновую активность полученной смеси (Табл. 1). В диапазоне концентраций диффузатов в пробах от 800 до 200 мкг белка/мл добавление Кон А не влияло на агглютинацию. Однако при разведении диффузатов до концентрации 100 мкг/мл агглютинирующая активность смеси снижалась. Это означает, что все лектины диффузатов связались с Кон А с образованием комплекса, неспособного агглютинировать эритроциты. При дальнейшем разведении пробы, как и следовало ожидать, проявлялась агглютинирующая способность Кон А.

Полученные данные свидетельствуют о том, что выявленные в составе диффузатов лектины являются гликопротеинами, в состав которых входят остатки глюкозы и/или маннозы.

Эксперименты с очисткой диффузатов от гликопротеинов на колонке с Кон А, иммобилизованном на сефарозе 4В (Кон А-сефароза), подтвердили этот вывод.

В результате связывания с Кон А диффузаты (200 мкг белка/мл), прошедшие через колонку, полностью теряли способность агглютинировать эритроциты (Рис. 7).

Контроли:

Диффузаты отрицательный Диффузаты после колонки положительный с Кон А-сефарозой Рис. 7. Исследование агглютинирующей активности диффузатов, прошедших через колонку с Кон А-сефарозой. Отрицательный контроль на аутоагглютинацию – раствор 150 мМ NaCl (рН 7.0). Положительный контроль – Кон А (5 мкг/мл).

Таким образом, в результате анализа легковымываемых белков оболочки пыльцевого зерна обнаружены эндогенные поливалентные лектины, являющиеся гликопротеинами.

4. Выделение водорастворимых лектинов оболочки пыльцевого зерна методом аффинной хроматографии и анализ их действия на активацию и прорастание Метод аффинной хроматографии позволяет осуществить быстрое выделение лектинов на углевод-презентирующих носителях, в том числе из неочищенного материала. В качестве аффинных сорбентов были выбраны сефадекс G-(декстран с низкой степенью сшивки) и ММП-Агароза (ММП, иммобилизованный на агарозе). Эти сорбенты часто применяют для выделения глюкозо/маннозоспецифичных лектинов (Gabius et al., 2004; Bezerra et al., 2006).

Выделение лектинов на сефадексе G-200 и их анализ В ходе процедуры выделения лектинов диффузаты наносили на колонку, после чего колонку промывали и элюировали связавшиеся белки.

Предварительные эксперименты показали непригодность D-глюкозы (0,2 и 0,5 М) для элюции. Возможно, искомые лектины проявляют специфичность к более крупным олигосахаридным фрагментам в составе сефадекса. Декстран высокомолекулярный гомополимер D-глюкозы с разнообразным количеством боковых цепей, присоединенных через -1,2, -1,3 или -1,4 связи, что усложняет поиск конкурентного сахарида. В таких случаях для элюции нередко используют растворы с низкими значениями рН (Gabius et al., 2004). В настоящей работы белки, связавшиеся с сефадексом, элюировали 30 мМ HCl (рН 2,0).

Характерная кривая выделения лектинов представлена на рисунке 8 а.

Лектины элюировались в виде одного пика. Их массовая доля составляла 4–5 % от общего количества белка, нанесённого на колонку. Таким образом, в оболочках 1 мг негидратированных пыльцевых зёрен содержится как минимум 0,02 мкг водорастворимых лектинов, проявляющих сродство к декстрану.

Электрофоретический анализ фракции выделенных лектинов в 11 % ДДСПААГ (Рис. 8 б) показал наличие в её составе пяти белков с молекулярными массами 64, 58, 51, 50 и 35 кДа. Разнообразие белкового состава нефракционированных диффузатов иллюстрирует дорожка 1 на том же рисунке.

Сопоставление этих двух белковых проб позволяет говорить о достаточно высокой избирательности очистки белков на сефадексе.

1 а б начало элюции 010 20 N фракции Рис. 8. Очистка лектинов, присутствующих в диффузатах оболочки пыльцевого зерна, с помощью сефадекса G-200:

(а) выход белковых фракций при аффинной хроматографии диффузатов;

(б) электрофоретический анализ фракции выделенных лектинов; дорожка 1 – диффузаты;

дорожка 2 – выделенные лектины (фракция № 27); справа указаны рассчитанные молекулярные массы лектинов (кДа); слева – положение белков-маркеров (кДа).

Анализ этой фракции показал, что очищенные на сефадексе белки при условии высокого их разведения агглютинируют эритроциты (Табл. 2).

Возможно, это связано с тем, что в составе фракции элюируются лектины гликопротеиновой природы, способные к самоингибированию при высоких концентрациях. Эти данные свидетельствуют о том, что в результате очистки на сефадексе получены поливалентные лектины.

Концентрация белка, мкг/мл Табл. 2. Выявление лектиновой активности декстран-специфичных белков.

Концентрация лектинов, мкг/мл Анализируемая проба 1 0,5 0,25 0,Декстран-специфичные ++ лектины +++ максимальная лектиновая активность, отсутствие агглютинации С использованием тест-культуры с низкой концентрацией клеток установлено, что белки, очищенные на сефадексе, способны стимулировать прорастание (Рис. 9 а) и влиять на величину мембранного потенциала вегетативной клетки (Рис. 9 б). Гиперполяризация плазмалеммы возрастала с увеличением концентрации белка в пробе.

а б Концентрация белка, мкг/мл 0 1 2 3 ---10 кл./мл 770 кл./мл 770 кл./мл + лектины Рис. 9. Действие декстран-специфичных лектинов на прорастание пыльцевых зёрен (а) и величину мембранного потенциала вегетативной клетки пыльцевого зерна (б).

Выделение лектинов на колонке с ММП-Агарозой и анализ их действия на прорастание В результате специфической элюции белков, связавшихся с ММП-Агарозой, с помощью 0,5 М ММП, была получена фракция лектинов, вышедших с колонки в виде одного пика (№ 32) (Рис. 10 а). Массовая доля этих маннозо-специфичных Е, мВ Прорастание, % лектинов по отношению ко всему внесенному на колонку белку составляла около 0,5 %.

Электрофоретический анализ данной лектиновой фракции в градиентном 8–25 % ДДС-ПААГ показал наличие в её составе 3 белков (Рис. 10 б, дорожка 2), молекулярные массы которых составляли 58, 69 и 74 кДа. Сравнивая белковый состав фракции, выделенной на сефадексе (Рис. 8), и фракции маннозоспецифичных лектинов (Рис. 10), следует отметить белок 58 кДа, возможно, общий для этих фракций, т.е. проявляющий сродство и к маннозе, и к декстрану.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»