WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Промоторные последовательности ВКГГ размерами 501 и 370 пн показали приблизительно одинаковый уровень экспрессионной активности в протопластах табака. Промотор ВКГГ размером 501 пн и промотор ВМГ размером 442 пн были клонированы в векторы pCambia 1281Z и pCambia 1291Z. Затем при помощи данных конструкций были получены трансгенные растения табака, которые после проведения гистохимического анализа с помощью субстрата x-gluc (рис. 11), были отобраны для количественного определения активности GUS в клеточных экстрактах.

Рис. 11. Гистохимический анализ экспрессии гена GUS в трансгенном по промотору ВМГ табаке. Экспрессия гена GUS детектируется визуально окрашиванием растительной ткани в синий цвет (на черно-белом изображении выделяется потемнением).

Для каждого промотора были отобраны по четыре разных трансгенных растения, из которых были выделены белки и проверена активность глюкуронидазы с помощью субстрата 4-MUG (4-метилумбеллиферил--Dглюкуронид) и продукта реакции 4-MU (4-метилумбеллиферон), способной к флюоресценции. Измерения флюоресценции проводили на спектрофлюориметре после 30 мин работы фермента. Концентрацию 4-MU определяли по калибровочной кривой, которую построили заранее. Результаты измерения активностей промоторов были выражены в pmol 4-MU мин-1мг-1 белка.

Для разных трансгенных растений активность гена GUS различалась, но в среднем для 35S промотора мы получили 482.6 pmol 4-MU мин-1мг-1 белка, для промотора ВМГ: 480.1 pmol 4-MU мин-1мг-1 белка, а для промотора ВКГГ: 442.pmol 4-MU мин-1мг-1 белка (табл. 1).

Таблица Результаты флюориметрического анализа экспрессионной активности гена GUS под управлением промоторов ВМЦК, ВКГГ и ВМГ в трансгенных растениях табака Трансгенное 35S промотор Промотор ВМГ Промотор ВКГГ растение 1 859.0 606.5 367.2 151.7 427.3 437.3 612.0 532.8 453.4 307.6 353.7 510.Ср. значение 482.6±106.4 480.1±37.7 442.1±19.По данным таблицы можно сделать вывод о том, что 35S промотор и промоторы вирусов мозаики георгина и кольцевой гравировки гвоздики одинаковы по экспрессионной активности. Полученные нами результаты в целом совпадают с данными по промоторам уже исследованных каулимовирусов. Следует отметить, что один и тот же промотор в разных трансгенных растениях проявляет различный уровень транскрипционной активности. Вариабельность экспрессии репортерного гена GUS в различных трансгенных растениях одного вида видимо возникают из-за различного их расположения в геноме и из-за общих физиологических и генетических различий между разными растениями выборки.

ВЫВОДЫ 1. Клонированы и секвенированы промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики. Уровень гомологии этих промоторов с промоторами других каулимовирусов составил приблизительно 50-60%.

Наиболее близким к промотору вируса мозаики георгина оказался промотор вируса мозаики ночной красавицы, а к промотору вируса кольцевой гравировки гвоздики – 35S промотор вируса мозаики цветной капусты.

2. Сравнительный анализ канонических регуляторных последовательностей промоторов каулимовирусов показал, помимо типичных повторяющихся последовательностей ССАСТ, TGACG и ТАТА, наличие других консервативных участков, функция которых не определена.

3. На основе одноцепочечных ДНК-матриц промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга созданы химерные формы промоторов вирусов мозаики цветной капусты, кольцевой гравировки гвоздики и мозаики георгина в различных комбинациях.

4. Промоторы вируса кольцевой гравировки гвоздики и вируса мозаики георгина проявляют транскрипционную активность в протопластах и трансгенных растениях табака N.tabacum. Для проявления экспрессионной активности для промотора ВКГГ достаточно последовательности размером 370 пн.

5. Количественный анализ активности исследуемых промоторов в трансгенных растениях табака при помощи субстрата 4-MUG показал, что 35S промотор и промоторы вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики проявляют одинаковый уровень экспрессионной активности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Кулуев Б.Р. Растительные параретровирусы // www.ofap.ru/portal/ejurnal /2006/kupi_08-2006.pdf. 2005. (Электронный учебник, зарегистрированный в отраслевом фонде алгоритмов и программ Государственного координационного центра информационных технологий).

2. Кулуев Б.Р. Поиск новых промоторов каулимовирусов и конструирование их химерных форм // Материалы XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов”. Том IV - М.: Изд-во МГУ, 2006. С. 22-23.

3. Кулуев Б.Р., Чемерис А.В. Промоторы каулимовирусов и конструирование их химерных форм методом ДНК шаффлинга // Материалы международной конференции “Генетика в России и мире”, посвященной 40 летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Москва, 2006. С.

105.

4. Кулуев Б.Р., Чемерис А.В. Cравнительный анализ последовательностей полногеномных промоторов вируса мозаики цветной капусты и вируса кольцевой гравировки гвоздики // Материалы Российской школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна. Москва–Пущино-на-Оке, 2006. С. 39.

5. Кулуев Б.Р., Чемерис А.В. Секвенирование полногеномного промотора вируса мозаики георгина и анализ регуляторных областей // Материалы Российской школы–конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100–летию со дня рождения С.И. Алиханяна.

Москва–Пущино-на-Оке, 2006. С. 5.

6. Кулуев Б.Р. Конструирование химерных форм полногеномных промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга // Материалы Четвертого съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова.

Пущино, 2006. С. 126-127.

7. Кулуев Б.Р., Чемерис А.В., Ибрагимов Р.И. Поиск каулимовирусов на территории Республики Башкортостан и исследование их полногеномных промоторов // Вестник Башкирского университета, 2007. №2. С. 24-26.

8. Кулуев Б.Р. Создание трансгенных растений с увеличенными и уменьшенными органами // Материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физикохимической биологии и биотехнологии. Уфа, 2007. С. 71-73.

9. Кулуев Б.Р. Родственные классическому 35S промотору промоторы других каулимовирусов // Материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физикохимической биологии и биотехнологии. Уфа, 2007. С. 73-75.

10. Кулуев Б.Р., Чемерис А.В. Амплификация и клонирование промоторов вируса мозаики георгина и вируса кольцевой гравировки гвоздики // Генетика, 2007. Т. 43, №11. В печати.

Кулуев Булат Разяпович Новые промоторы каулимовирусов и конструирование их химерных форм Специальность 03.00.04 - биохимия 03.00.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Лицензия № 0177 от 10.06.96 г.

Подписано в печать Отпечатано на ризографе.

Формат 60х84 1/16. Усл.-печ. л. 1,5. Уч.-изд. л. 1,Тираж 100 экз. Заказ № 313.

450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, ГОУ ВПО «Башгосмедуниверситет РОСЗДРАВА»

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»