WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Оказалось, что уровень гомологии промоторов каулимовирусов почти совпадает с уровнем гомологии последовательности геномов, и в построенном филогенетическом древе каулимовирусы образовали те же филогенетически связанные группы. Вирус мозаики георгина также является одним из представителей каулимовирусов. По данным GenBank геном данного вируса секвенирован лишь частично, тем не менее по анализу известных последовательностей было выявлено, что этот вирус имеет большее филогенетическое родство с ВМН и ВМНК. Исходя из полученных нами данных, были подобраны праймеры для амплификации промоторов ВМН, ВОЖЗ, ВМГ и ВКГГ и был осуществлен поиск инфицированных каулимовирусами растений в Уфимском регионе. В результате из перечисленных вирусов в г. Уфе был обнаружен лишь вирус мозаики георгина (ВМГ).

2. Амплификация и клонирование промотора вируса мозаики георгина. Промотор ВМГ и его фланкирующие участки по данным GenBank не секвенированы, и это не позволяло подобрать удобные праймеры для амплификации полногеномного промотора. Было решено амплифицировать более протяженный участок нуклеотидной последовательности, включающий промоторную область. При подборе праймеров использовались лишь известные последовательности генома ВМГ и подбирались участки, наиболее близко прилегающие к промотору. Наиболее подходящей оказалась следующая пара праймеров:

5-CAGTGACTCATCCTCCAATA-3, 5-AATATCTACTGACATTTCTT-3.

Размер амплифицируемого участка составил приблизительно 1290 пн (рис. 2).

Рис. 2. Электрофореграмма амплификата участка генома ВМГ, размером около 1290 пн, из образцов ДНК инфицированного георгина.

Маркером служит ДНК фага, расщепленная эндонуклеазой рестрикции BstEII.

Проведенный анализ нуклеотидной последовательности позволил оценить расположение и подобрать праймеры для амплификации самого промотора, размер которого, судя по гомологии с родственными каулимовирусами, не должен превышать 400 пн. В итоге был амплифицирован промоторный участок генома вируса мозаики георгина размером 442 пн, который был клонирован в фагмидном векторе pKRX.

3. Амплификация и клонирование промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики. Растения, листья которых по морфологическим признакам инфицированы вирусом кольцевой гравировки гвоздики, были получены из Института вирусологии, микробиологии и биологической безопасности (г. Брауншвейг, Германия). В GenBank опубликована последовательность генома вируса кольцевой гравировки гвоздики. Для оценки расположения промотора провели выравнивание генома ВКГГ с геномами 4-х штаммов ВМЦК. Далее, учитывая выравнивание промоторных последовательностей наиболее близкородственных каулимовирусов, осуществили подбор праймеров для амплификации промотора ВКГГ, при этом отдавали преимущество более консервативным участкам. Было подобрано 3 праймера:

CERVFltF1 5'–ATTAAAAGAACAATGGCAAG–3', CERVFltF2 5'–AGAAGATTTAATGGCAATCC–3', CERVFltR 5'–AGGACTTAGGCTCAACACAT–3'.

При амплификации с праймерами CERVFltF1 и CERVFltR размер ампликона должен составить 651 пн, а с праймерами CERVFltF2 и CERVFltR - 501 пн. Из 4-х образцов ДНК, выделенных из листьев гвоздичных, нам удалось амплифицировать ДНК размерами около 500 пн и 650 пн (рис. 3), что подтвердило наличие ВКГГ в листьях гвоздичных. Далее оба фрагмента ДНК, отличающиеся лишь расположением праймеров, были клонированы в фагмидном векторe pKRX.

Рис. 3. Результаты амплификации промоторного участка генома ВКГГ размером 501 пн из различных инфицированных представителей гвоздичных (г.

Брауншвейг, Германия). Маркер - pBluescript II SK+, расщепленная эндонуклеазой рестрикции HpaII; 1 - Lychnis (смолка обыкновенная или клейкая); 2, 3 - Dianthus caryophyllus (гвоздика садовая); 4 - Dianthus barbatus (гвоздика турецкая); 5 - представитель семейства гвоздичных, видовая принадлежность которого не определена.

4. Секвенирование и анализ нуклеотидной последовательности промотора вируса мозаики георгина. Участок генома ВМГ размером 1290 пн был секвенирован с применением “прямого” и “обратного” праймеров.

Сравнительный анализ показал, что была клонирована последовательность, включающая часть гена 6, промотор, большой межгенный спейсер и 7-ю открытую рамку считывания вируса мозаики георгина. Нуклеотидная последовательность большого межгенного спейсера размером 678 пн был зарегистрирован в GenBank (accession number EF463101). Промотор ВМГ частично оказался гомологичным промоторам других каулимовирусов:

гомология с промотором вируса мозаики норичника составила 60%, а с промотором вируса мозаики ночной красавицы – 63%. Сравнительный анализ регуляторных областей промоторов ВМГ, вирусов мозаики норичника и ночной красавицы показал следующее: ССАСТ-бокс у вируса норичника имеет каноническую последовательность, у ВМГ она представлена последовательностью ССААТ, у вируса ночной красавицы – GCAAC. У вирусов норичника и ночной красавицы 1-й TGACG мотив представлен последовательностью TGACG, а у ВМГ тимин заменен на аденин; 2-й TGACG мотив у всех трех видов представлен последовательностью TGACG. ТАТА бокс у всех трех видов представляет собой консенсусную последовательность ТАТАТАА.

Нуклеотидная последовательность промотора ВМГ размером 442 пн была зарегистрирована в GenBank (accession number EF513491). Кроме часто исследуемых регуляторных участков, у промоторов ВМГ, ВМН и ВМНК была выявлена еще одна консенсусная последовательность. Оказалось, что у всех этих трех каулимовирусов в сайте инициации транскрипции имеется каноническая последовательность GATCA(A)TCGAAA (рис. 4).

Рис. 4. Консенсусная последовательность ДНК, расположеная за ТАТА боксом и совпадающая с 3' концом -18 +1 домена промоторов ВМГ и ВМНК.

5. Секвенирование и анализ нуклеотидной последовательности промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики. Клонированные в pKRX фрагменты генома ВКГГ размером 501 и 651 пн были секвенированы и последовательность промоторного участка размером 455 пн была зарегистрирована в GenBank (accession number EF513492). Поиск сходных последовательностей в базе данных генов c помощью программы “Megablast” (доступной на вебсайте NCBI) показал 95%-ную гомологию секвенированного нами промотора с промоторным участком изолята вируса ВКГГ из Нидерландов (accession number NC 003498). Выравнивание секвенированного нами промотора ВКГГ с последовательностью промотора индийского изолята ВКГГ (accession number AJ853858) c помощью программы “Megalign” показало уровень гомологии 96%. Уровень гомологии промоторов ВКГГ и ВМЦК составил 48%. Сравнительный анализ последовательностей промоторов вируса мозаики цветной капусты и вируса кольцевой гравировки гвоздики показал, что ССАСТ-бокс у промотора ВКГГ отличается от такового промотора ВМЦК и представлен последовательностью СТАСТ; ТАТА-бокс представлен у ВКГГ последовательностью ТАТАТААAGG и у ВМЦК последовательностью ТАТАТАAGGA. 1-й TGACG мотив – у ВМЦК представлен канонической последовательностью TGACG, у ВКГГ последовательностью AGACG, 2-й TGACG мотив у обоих видов представлен последовательностью TGACG.

ССАСТ и TGACG боксы у промотора ВМЦК имеют один общий нуклеотид Т (Sanger et al., 1990), при этом в отличие от ВМГ, до ССАСТ бокса в геноме у ВМЦК не было обнаружено схожих последовательностей. Следует отметить, что после второго TGACG мотива у ВМЦК есть еще одна последовательность ССАСТ, что также совпадает с данными литературы о наличии повторов этих последовательностей (Sanger et al., 1990).

6. Конструирование химерных форм промоторов каулимовирусов методом ДНК шаффлинга. Промоторы ВМЦК (510 пн), ВКГГ (501 пн) и ВМГ (442 пн) были вырезаны из фагмидного вектора pKRX по сайту рестрикции BssHI. После этапов самолигирования, очистки и осаждения, проводили наработку одноцепочечных последовательностей при помощи амплификации по типу катящегося кольца с использованием ДНК-полимеразы фага рhi29. Для затравки использовали праймеры Т3, Т7 и праймеры, подобранные к самим промоторам. При использовании Т7 праймера образуется плюс-цепь, а при использовании Т3 праймера минус-цепь (рис. 5).

Рис. 5. Общая схема получения одноцепочечной ДНК при помощи ДНКполимеразы фага рhi29.

Одноцепочечные формы промоторов ВМЦК, ВКГГ и ВМГ были использованы нами в качестве исходного материала при проведении ДНК шаффлинга. Для удобства промоторы в одноцепочечной форме были обозначены нами в соответствии с названием вируса и праймера, с которого данную цепь ДНК нарабатывали (форвард – F, реверс – R): 35SF, 35SR, CERVF, CERVR, DMVF, DMVR. Для проведения ДНК шаффлинга, использовали все комбинаций разных цепей ДНК этих промоторов: 35SF+CERVR (смесь 1), CERVF+35SR (смесь 2), 35SF+DMVR (смесь 3), DMVF+35SR (смесь 4), CERVF+DMVR (смесь 5), DMVF+CERVR (смесь 6).

В соответствии с данными по гомологии промоторов каулимовирусов, были смешаны разные цепи ДНК промоторов ВМЦК и ВКГГ, обработаны ДНКазой I, при этом были получены фрагменты ДНК размерами около 50 - 300 пн. Далее был проведен первый раунд амплификации без добавления праймеров, при котором происходит постепенное увеличение размеров восстанавливаемых фрагментов и образование их пула. В ходе первого раунда ДНК шаффлинга генерируется бибилиотека рекомбинантов, несущих точки состыковки – кроссоверы, где происходит перестановка отдельных частей матрицы с одной родительской последовательности на другую. Затем был проведен 2-й раунд амплификации с использованием специально подобранных праймеров, фланкирующих исходные гены. В результате при смешивании (+)-цепи промотора ВМЦК с (-)-цепью промотора ВКГГ (1 смесь) и двух раундов ПЦР, получили амплификат размером больше 500 пн (рис. 6). С помощью электрофоретического анализа был показан неоднородный состав амплификата, содержащий ДНК различного размера.

Благодаря тому, что при втором раунде ПЦР использовали “форвард” праймер промотора ВМЦК и “реверс” праймер промотора ВКГГ, в качестве конечных продуктов реакции нарабатываются лишь химерные молекулы ДНК. Для контроля использовали смесь промоторов ВМЦК и ВКГГ в двуцепочечной форме и использовали эту матрицу во втором раунде ПЦР, при этом наработка продукта, как и ожидалось, не происходила. При смешивании (+)-цепи промотора ВКГГ и (-)-цепи промотора ВМЦК (смесь 2) получили однородный амплификат размером около 500 пн (рис 6). При использовании форвард праймера промотора ВКГГ и реверс праймера ВМЦК, амплификация смеси промоторов в двуцепочечной форме также не проходит (минус-контроль).

Рис. 6. Электрофореграмма амплификатов после проведения двух раундов ПЦР ДНК шаффлинга промоторов ВМЦК и ВКГГ.

1 – результат ДНК шаффлинга смеси 1 ((+) цепь промотора ВМЦК и (-) цепь промотора ВКГГ); 2 – “минус” контроль для смеси 1 (ПЦР анализ смеси промоторов ВМЦК и ВКГГ в двуцепочечной форме при помощи форвард праймера промотора ВМЦК и реверс праймера ВКГГ); 3 - результат ДНК шаффлинга смеси 2 ((+) цепь промотора ВКГГ и (-) цепь промотора ВМЦК); 4 - “минус” контроль для смеси 2 (ПЦР анализ смеси промоторов ВМЦК и ВКГГ в двуцепочечной форме при помощи форвард праймера промотора ВКГГ и реверс праймера ВМЦК).

Полученные амплификаты были клонированы в плазмиде pKRX, белые колонии пересеяли, выделили плазмиды и провели ПЦР анализ. Как и ожидалось, были получены амплификаты различного размера (рис. 7), все они были приблизительно равны или больше по размеру, чем промоторы ВМЦК и ВКГГ.

Рис. 7. Электрофореграмма ПЦР анализа клонов, полученных при клонировании амплификата из смеси 1 после ДНК шаффлинга в фагмидный вектор pKRX. С 1 по 7 - номера анализируемых клонов; 8 – амплификат промотора ВКГГ размером 501 пн (маркер).

Последовательности промоторов первых двух клонов были секвенированы. Анализ секвенированной последовательности показал, что оба клона содержат химерные формы промоторов ВМЦК и ВКГГ. Размер промотора первого клона составил 905 пн (рис. 8). В начале располагается полноразмерный промотор ВМЦК (510 пн), затем 5'-конец промотора ВКГГ размером 253 пн, далее часть фагмидного вектора pKRX размером 75 пн (область полилинкера) и в конце находится 3'-конец промотора ВКГГ размером 67 пн. Размер промотора второго клона составил 715 пн где последовательно расположены 5'-конец промотора ВМЦК размером 214 пн и полноразмерный промотор ВКГГ (501 пн) (рис. 8).

Рис. 8. Расположение составных частей в химерных промоторах 1 го и 2 го клонов.

В итоге было получено около 30-ти клонов, промоторы некоторых из них были секвенированы и оказались химерными, при этом были использованы все возможные комбинации промоторов каулимовирусов (смеси 1 – 6) (рис. 9).

Рис. 9. Электрофореграмма ПЦР анализа клонов, полученных при клонировании амплификата из смеси 4 (DMVF+35SR) в фагмидный вектор pKRX после ДНК шаффлинга. 1 – амплификат промотора ВМЦК (маркер – пн); 2 – промотор ВМГ (маркер – 442 пн); 3 – 25 – номера анализируемых клонов.

Было выбрано три химерных промотора для клонирования в бинарный вектор pCambia 1304, с целью проведения анализа их экспрессионной активности в клетках E.coli и A.tumefaciens.

7. Анализ экспрессионной активности генов GUS и GFP под управлением химерных и природных форм промоторов каулимовирусов в клетках E.coli, A.tumefaciens и N.tаbacum. Промоторы ВКГГ (501 пн и 370 пн), ВМГ (442 пн) и три химерных промотора были клонированы в вектор pCambia 1304, где они могли управлять экспрессией генов GUS и GFP одновременно.

Полученными ДНК-конструкциями трансформировали компетентные клетки E.coli и A.tumefaciens и анализировали экспрессию гена GUS при помощи субстрата x-gluc. Все анализируемые промоторные последовательности показали примерно одинаковую, визуально детектируемую, активность как в клетках E.coli, так и в клетках A.tumefaciens.

Конструкции вектора pCambia 1304 с промоторами ВКГГ (501 и 370 пн) и ВМГ (442 пн) были использованы для трансформации протопластов табака и анализа транзиентной экспрессии репортерных генов GUS и GFP в растительных клетках. С помощью данного метода мы показали, что амплифицированные нами промоторные последовательности ВМГ и ВКГГ являются достаточными для проявления транзиентной экспрессии генов GUS и GFP в растительных клетках (рис. 10).

Рис. 10. a) Транзиентная экспрессия гена GUS под управлением промотора ВКГГ размером 501 пн в протопластах табака (трансформированный протопласт окрашивается в синий цвет и на рисунке выглядит более темным);

б) Транзиентная экспрессия гена GFP под управлением промотора ВМГ в протопластах табака (трансформированные протопласты светятся ярким зеленым цветом и на рисунке выглядят более светлыми).

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»