WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Далее из рис. 1 видно, что у подопытных мышей частота встречаемости округлых сперматид с микроядерными аберрациями на 3, 7 сут не выходит далеко за пределы установленного для этих животных уровня спонтанного мутагенеза, но достоверно возрастает на 14 сут фиксации. На 21-35 сут после начала эксперимента частота встречаемости аберрантных округлых сперматид не отличалась от контроля. Статистически достоверное превышение частоты встречаемости ранних постмейотических клеток со следами хромосомных поломок над контролем вновь наблюдалась на 56 и 100 сут, причем в последнем случае эффект воздействия мутагена проявился особенно сильно.

Использованный в работе тест на аномалии форм головок спермиев показал (таблице 1), что на 28 сут фиксации в гонадах подопытных мышей частота Таблица 1. Частота встречаемости тестикулярных спермиев с аномальными формами головок (в %) у мышей SAMP1 контрольной и подопытной групп.

Примечание: * – различия по сравнению с контролем статистически достоверны при p0.05.

Рис. 1. Динамика изменений частоты встречаемости сперматогенных клеток с микроядрами у контрольных и подопытных мышей SAMP1.

‰ СПЕРМАТОГОНИИ ОКРУГЛЫЕ СПЕРМАТИДЫ ‰ Примечание: * – различия по сравнению с контролем статистически достоверны при p0.05; вертикальные линии показывают стандартную ошибку среднего.

встречаемости аберрантных форм в популяции тестикулярных спермиев увеличивается в 3 раза по сравнению с контролем, а на 100 сут последействия снижается до уровня, свойственного уровню спонтанного мутагенеза. Тот факт, что на 28 сут после начала эксперимента число морфологически аномальных гамет значительно возрастает, подтверждает, что клетки, находящиеся в момент воздействия мутагенов на стадии Число клеток с микроядрами Число клеток с микроядрами Рис. 2. Многообразие головок спермиев у мышей SAMP1, возникшее под влиянием мутагена дипина.

Обозначение: Н – норма.

активного премейотического синтеза ДНК (прелептотены-лептотены) проявляют повышенную генетическую чувствительность.

Весь спектр морфологически аномальных ядер спермиев, выявленный в семенниках мышей SAMP1, подвергшихся геннотоксическому эффекту дипина, представлен на рис 2.

II. Количественный анализ клеток сперматогенного эпителия.

Результаты подсчетов числа сперматогенных клеток различных типов, а также клеток Сертоли у мышей контрольной и подопытной групп на разных сроках фиксации представлены в таблице 2.

На 3 сут после введения самцам дипина число сперматогониев, пахитенных сперматоцитов и округлых сперматид достоверно меньше, чем в контроле, тогда как снижение числа тестикулярных спермиев и клеток Сертоли не существенно. На 7 сут фиксации в семенниках подопытных животных только число сперматогониев статистически значимо отличалось от контроля. Повреждающий эффект наиболее ярко проявился на 14 сут последействия, о чем свидетельствует практически полное отсутствие в образцах семенников сперматогониев, пахитенных сперматоцитов и клеток Сертоли; снижение числа округлых сперматид и морфологически сформировавшихся спермиев было не столь катастрофично. Между тем у части изученных животных число округлых сперматид и клеток Сертоли достигало нулевых значений. На 21 сут после действия дипина значительно возрастало число сперматогониев, тестикулярных Таблица 2. Количественный состав клеток сперматогенного эпителия у мышей SAMP1 контрольной и опытной групп (106).

Примечание: СГ – сперматогонии, ПС – пахитенные сперматоциты, ОС – округлые сперматиды, СП – сперматозоиды, КС – клетки Сертоли, * – различия по сравнению с контролем статистически достоверны при p0.05.

спермиев и клеток Сертоли. На 28 сут в семенниках подопытных мышей пул постмейотических клеток вновь резко уменьшался по сравнению с контролем. На 35 сут последействия сумарное число всех изученных типов клеток достигает минимального значения, по сравнению с предыдущими сроками фиксации. На 56 сут фиксации у мышей, подвергшихся мутагенному воздействию, наблюдается увеличение числа сперматогониальных, мейотических, постмейотических клеток и клеток Сертоли.

Через 100 сут с начала эксперимента число клеток всех изученных типов в семенниках подопытных и контрольных мышей уже не различалось.

III. Содержание ДНК-фуксина в сперматогенных клетках.

Цитоспектрофотометрическое изучение содержания ДНК-фуксина в сперматогенных клетках контрольных и подопытных мышей SAMP1, результаты которого представлены в таблице 3, показало, что через 3 дня после введения животным Таблица 3. Содержание ДНК-фуксина (у.е.) в сперматогенных клетках контрольных и подвергшихся воздействию дипина мышей.

Примечание: ПС – пахитенные сперматоциты, ОС – округлые сперматиды, ТСП – тестикулярные сперматозоиды, * – различия по сравнению с контролем статистически достоверны при p0.05.

дипина количество ДНК в пахитенных сперматоцитах и тестикулярных спермиях было достоверно ниже, чем в контроле; в то время как, содержание ДНК в округлых сперматидах соответствовало теоретически ожидаемому гаплоидному уровню (различия по сравнению с контролем недостоверны). На 100 сут эксперимента различий между контролем и опытом по всем типам изученных клеток не было обнаружено.

IV. Гистологический анализ структуры сперматогенного эпителия.

На рис. 3. показаны структурные эффекты влияния дипина на сперматогенез мышей SAMP1 в разное время после начала эксперимента.

Гистологическая картина сперматогенеза у контрольных мышей линии SAMPпрактически на всем протяжении эксперимента была близка к таковой у нормально стареющих мышей в норме (рис. 3А); и лишь на 100 сут последействия у этих животных появляется большое число канальцев со значительными нарушениями морфологии сперматогенного эпителия (результаты не показаны).

В опыте на 3 и 7 сут фиксации структура сперматогенного эпителия сохраняет вполне нормальный упорядоченный вид. В большинстве случаев дифференцирующиеся половые клетки разных генераций располагаются сравнительно правильными концентрическими слоями вокруг просвета канальцев (рис. 3Б).

На 14 сут последействия у подопытных мышей сперматогенный эпителий сильно редуцирован: практически полностью отсутствуют клетки мейотического ряда, редко встречаются сперматогонии, причем в некоторых канальцах они вовсе отсутствуют;

превалируют популяции округлых сперматид и клеток Сертоли (рис. 3В).

На 21 сут в эксперименте нарушения морфологии сперматогенного эпителия носили еще более выраженный характер, чем на 14 сут фиксации (рис. 3Г). Обширные пласты мейотических и постмейотических клеток отслаивались от стенки канальца и/или слущивались в просвет. В некоторых участках сперматогенного эпителия отсутствовали все типы клеток, кроме клеток Сертоли и сперматогониев.

У подопытных животных структурные нарушения сперматогенеза были максимальными на 28 сут фиксации: нормальное течение сперматогенного процесса было нарушено во всех без исключения канальцах. Первое, что бросается в глаза – отсутствие в большинстве канальцев тех или иных типов сперматогенных клеток:

можно выделить канальцы, содержащие только клетки Сертоли, или только клетки Сертоли и сперматогонии (рис. 3Е), канальцы без мейотических клеток, или канальцы без сперматид и спермиев (рис. 3Д).

На 35 сут последействия во многих канальцах отмечено появление большого числа сперматогониев, встречаются пахитенные сперматоциты, а также округлые сперматиды и спермии. Между тем в большинстве канальцев сперматогенная система проявляет все признаки беспорядочного и регрессивного развития (рис. 3З), а в некоторых канальцах процессы дегенерации заходят так далеко, что исчезают все следы сперматогенеза.

На 56 день фиксации в канальцах у подопытных животных прогрессивные положительные процессы преобладают над регрессивными, отрицательными.

Целостность сперматогенного эпителия в основных чертах восстанавливается (результаты не показаны).

На 100 сут после действия дипина регенерация сперматогенной системы у подопытных самцов завершалась формированием семенных канальцев по структуре сперматогенного эпителия не отличающихся от контроля (рис. 3И). Важно отметить, что у подопытных самцов, как и у контрольных самцов этого же срока фиксации, отмечено большое число канальцев с полностью разрушенной структурой (результаты не показаны).

В ряде случаев на срезах семенников подопытных мышей вблизи от rete testis выявились новообразованные молодые семенные канальцы, содержащие клетки похожие на гоноциты и молодые клетки Сертоли (рис. 3Ж).

V. Изучение пролиферативной активности клеток Сертоли. Как показало радиоавтографическое исследование, у подопытных самцов линии SAMP1, в отличие от контроля, на отпечатках семенников среди интерфазных клеток Сертоли встречались ядра, меченные H3-тимидином (рис.4А,Б). Кроме того, на срезах были обнаружены единичные митотические фигуры клеток Сертоли (рис. 4В). У подопытных мышейгибридов CBAC57/Bl6 пролиферативная активность этих клеток была более высокой.

Рис. 3. Срезы семенников контрольных – А и подопытных – Б-И мышей.

Б – 7 сут, В – 14 сут, Г, Ж – 21 сут, Д, Е – 28 сут, З – 35 сут, И – 100 сут фиксации.

Обозначения: * – ядра клеток Сертоли, § – каналец, содержащий только удлиняющиеся сперматиды и клетки Сертоли, # – участок канальца, содержащий только клетки Сертоли и сперматогонии, † – каналец без мейотических клеток, ‡ – каналец без постмейотических клеток, ДСЭ – дезорганизация сперматогенного эпителия, МК – каналец похожий на молодой, МП – межклеточные пространства, ОТ – отслоение сперматогенного эпителия, ПС – ядра пахитенных сперматоцитов, СГ – ядра сперматогониев, СК – слущивание сперматогенных клеток в просвет канальца, ЦВ – цитоплазматические вакуоли.

Рис. 4. Ядра пролиферирующих и интерфазных клеток Сертоли на отпечатках (А,Б) и срезах (В) семенников подопытных мышей линии SAMP1.

Обозначения: * - интерфазные ядра клеток Сертоли, ДКС - деление клетки Сертоли.

ОБСУЖДЕНИЕ Известно (Mller, Streffer, 1994), что в норме в гонадах самцов млекопитающих число клеток с микроядерными аберрациями обычно не превышает 2-4‰, но увеличивается в 5-10 раз при индуцированном радиационном или химическом мутагенезе (Luhdetie et al., 1986; Allen et al., 1994, 1996; Kunugita et al., 2002). У ускоренно стареющих мышей линий SAM развитие половых клеток происходит на фоне высокой частоты спонтанных микроядерных аберраций, которая приближается к уровню индуцированного мутагенеза (Гопко и др., 2003; Гордеева, 2000; Захидов и др., 2001, 2002). Результаты настоящей работы подтверждают эти данные: у контрольных животных на всех сроках фиксации частота сперматогониев и округлых сперматид с хромосомными нарушениями не опускалась ниже 7‰, а в среднем составляла 14.5‰.

Отсутствие у мышей SAMP1 выраженного цитогенетического (микроядерного) эффекта в популяции сперматогониев с 3 по 28 сут после действия дипина скорее всего связано с угнетающим действием этого высокоактивного молекулярного мутагена на развитие стволовых и активно пролиферирующих клеток, с остановкой последних на разных фазах митотического цикла, и последующей элиминацией большого числа клеток вследствие глубоких, необратимых нарушений в структуре их генетического аппарата. В то же время, достоверное увеличение доли генетически аномальных форм в популяции сперматогониев у подопытных мышей на 35 сут эксперимента, вероятно, является следствием, очищения стволового компартмента от наиболее дефектных клеток; оставшиеся же после отбора сперматогонии, хотя и несут хромосомные нарушения, сохраняют способность к дифференцировке.

Неодинаковая частота выхода округлых сперматид с микроядрами на 3, 7 и 14 сут фиксации говорит о различной генетической чувствительности мейотических клеток, которые в момент воздействия дипина, согласно кинетике сперматогенеза у мышей, находились, соответственно, на стадиях мейотических делений, средней пахитены и прелептотены-лептотены. Более высокая восприимчивость последних по сравнению с продвинутыми в развитии мейоцитами связана, вероятно, с проходящей в них репликацией и, следовательно, с большей доступностью ДНК для взаимодействия с мутагеном. Тест на аномалии форм головок спермиев на 28 сут фиксации отчасти подтверждает это положение.

Тот факт, что у подопытных мышей на 35-100 сут существенно увеличивается частота микроядерных форм в популяции округлых сперматид, может быть следствием либо увеличения доли генетически аберрантных стволовых клеток, и/или нарушения механизмов клеточного отбора в процессе дифференцировки сперматогониев. Однако скачки частот сперматогониальных и мейотических микроядер на отдаленных сроках последействия свидетельствуют в пользу первого предположения. Похоже самые пластичные, базисные структуры сперматогенной системы, а именно стволовые клетки, подвергшись воздействию дипина, получили дополнительную порцию генетической нестабильности, которая, как известно (Захидов, 2004), усиливает мутационную составляющую.

Первое, что открывается при анализе результатов количественного и гистоморфологического исследования сперматогенеза у подопытных животных – это фактически полное несоответствие этих результатов между собой у некоторых самцов на 14 сут после мутагенного вмешательства. Так, если в суспензии клеток, полученной при механическом разрушении гонад, округлые сперматиды и клетки Сертоли отсутствовали, то на гистологических срезах они довольно легко выявлялись в большом числе. Скорее всего, это является следствием того, что химический мутаген дипин, наделенный большим потенциалом разрушения, нарушает структуру клеток и ядер, что делает их неустойчивыми к механическим воздействиям.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»