WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Исследование 1563 образцов крови на наличие провирусной ДНК ВЛКРС, проведенное в рамках выполнения диссертационной работы, показало идентичность результатов, полученных с помощью реакции иммунной диффузии (РИД) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) в интервале от 30 до 100% случаев. Анализ данных собственных исследований в контексте с результатами исследований других авторов показывает, что наблюдаемое в ряде случаев несовпадение результатов РИД и ПЦР не является указанием на некомпетентность какого-либо из двух методов анализа, а является следствием различных методических приемов определения носителей ВЛКРС. Если РИД-диагностика ориентирована на выявление антител к ВЛКРС, то есть затрагивает реакцию организма в ответ на наличие ВЛКРС, то ДНК-диагностика позволяет выявлять собственную провирусную ДНК ВЛКРС вне зависимости от реакции организма на инфекцию. Из литературных данных известно, что лейкоз – это хроническое заболевание с волнообразным течением, во время развития которого у одного и того же животного может подниматься и снижаться уровень антител, количество лимфоцитов, исчезать и появляться вирусная РНК, количественно меняться уровень провирусной ДНК. В этой связи, точность диагностики вирусоносителей определяется не только методом исследований, но и зависит от периода развития заболевания. Сопутствующие заболевания, стельность могут так же оказывать влияние на результаты РИД исследований. Таким образом, полученные нами данные показывают, что каждый из используемых методов анализа (РИД и ДНК-анализ) имеет свои преимущества и недостатки. Исходя из изложенного выше, становится понятным, что для результативной диагностики взрослых животных необходимо комбинировать различные методы анализа, подбирать оптимальный период отбора образцов, то есть работать индивидуально с каждым животным, что в условиях современного производства достаточно сложно и, в большинстве случаев, невыполнимо.

В этой связи, нами предложена схема, основанная на использовании технологии ДНК-анализа и направленная на ранее выявление и отделение от основного стада телят-носителей ВЛКРС. Использование данной схемы особенно актуально в том случае, если в стаде высок процент инфицированных животных. Так как используемая нами технология ДНК-анализа обеспечивает выявление непосредственно провируса, результаты анализа не зависят от возраста и состояния животного. Нами установлено, что процент инфицированных телят в возрасте 3-4 месяцев (по данным ДНКанализа) практически соответствует проценту РИД-позитивных животных того же хозяйства, но в более позднем возрасте, что позволяет предположить, что заражение животных происходит в возрасте до трех месяцев.

С целью определения времени и возможного способа инфицирования был проведн анализ глубокостельных коров в хозяйствах ОАО «Племзавод им. В.И.Чапаева» (n=27) и АПФ «Нива» (n=27), которые по результатам РИД являлись носителями ВЛКРС. В момент отла у матери и телнка были отобраны пробы крови, которые исследовали с использованием ПЦР. Процедуру повторяли каждые полтора месяца до достижения телятами возраста 6 месяцев.

Последнее ПЦР исследование совмещали с плановым серологическим исследованием. Телята до двух месяцев содержались в индивидуальных домиках, при всех зооветеринарных манипуляциях применялся только одноразовый инструмент. Результаты анализа обобщены в таблице 1.

Таблица Динамика выявления провирусной ДНК ВЛКРС у телят в зависимости от возраста Доля телят-носителей ВЛКРС % ДНК-анализ (ПЦР) РИД Хозяйство при 1,5 3 4,6 мес.

рождении мес. мес. мес.

ОАО «Племзавод 0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,им.В.И. Чапаева» АПФ «Нива» 0 7,4 7,4 7,4 7,4 7,Как показано в таблице 1, исследование телят при рождении не выявило ни одного носителя провирусной ДНК ВЛКРС. Вирусоносители в каждом из хозяйств появились по результатам второго исследования (3,7-7,4%), проведенного в возрасте 1,5 мес. Исследование проб молозива (n=10), полученного от носителей ВЛКРС (по данным ПЦР анализа) не выявило наличия провирусной ДНК ВЛКРС, несмотря на присутствие ее в крови коров. Результаты проведенного анализа показывают отсутствие в молозиве провирусной формы ВЛКРС (в количествах, достаточных для определения методом ПЦР), однако не исключают наличие в молозиве РНКформы ВЛКРС. Исследования, проведнные в возрасте 3- и 4,5-х месяцев подтвердили полученные ранее результаты. Новых инфицированных животных в эти периоды выявлено не было. Исследование всей выборки телят в возрасте 6-и месяцев методом РИД показало полное совпадение результатов анализа, полученных обоими методами: РИД-анализ дал положительный результат только у ПЦР-положительных телят.

Важная роль соблюдения зооветеринарных мероприятий в оздоровлении стад от лейкоза была нами продемонстрирована при исследовании телят ООО СК «Октябрь» Калининского района (n=80), где были выявлены нарушения режима асептики при зооветеринарных манипуляциях, инфицированные и здоровые животные контактировали друг с другом. Исследование, проведенное в возрасте 3-х месяцев, показало наличие провирусной ДНК ВЛКРС у 8и телят (10%). Повторное ДНК-исследование, проведнное в возрасте 6-и месяцев, показало наличие ещ 16 носителей ВЛКРС (+20%). Плановое РИД-исследование в возрасте 6-и месяцев полностью подтвердило данные ПЦР.

Таким образом, установлено, что ДНК-анализ, основанный на использовании метода ПЦР, позволяет выявлять инфицированных животных в возрасте 1,5 месяцев, а, следовательно, дат возможность разделять телят на здоровых и вирусоносителей до 2-х месячного возраста. При содержании телят в индивидуальных домиках анализ и разделение телят необходимо проводить до объединения их в группы, что значительно снизит риск распространения инфекции. Предлагаемая нами схема оздоровления стад от лейкоза с описанием мероприятий, сроков и порядка их реализации представлена в таблице 2.

Важным аспектом ДНК-диагностики ВЛКРС является исследование импортного скота с целью предотвращения завоза ВЛКРС.

Применение ДНК-диагностики эффективно и на последних этапах оздоровления стад. Комбинированное применение ДНК-анализа с другими методами снижает риск ложноотрицательных результатов, то есть не выявления скрытого вирусоносителя, и, следовательно, избавляет от необходимости возврата к проблеме через некоторое время. Таким образом, ДНК-диагностика, основанная на методе ПЦР, - один из инструментов, позволяющих решать проблему оздоровления стад от лейкоза на качественно новом уровне.

Таблица Схема реализации оздоровительных мероприятий с использованием ПЦР – диагностики у телят Этап Срок и порядок реализации Формирование группы те- При достижении животными возлочек (возраст 1,5-2 мес.) раста 1,5 месяцев взятие крови специалистами хозяйства и доставка в лабораторию в шприцах типа «Моновет» с ЭДТА или цитратом в качестве консерванта.

Срок реализации – по мере формирования группы от 50 голов.

ДНК-диагностика (диагно- Реализуется в специализированной стика методом ПЦР) лаборатории Формирование группы Производится специалистами хоПЦР-отрицательных живот- зяйства по результатам анализов ных. Удаление ПЦРположительных телочек на откорм или на другую ферму РИД-диагностика в группе Реализуется специалистами хозяйПЦР-отрицательных тело- ства чек с целью окончательного разделения групп инфицированных и здоровых животных (возраст 5-6 месяцев) 3.2. Усовершенствование способа ДНК-анализа, основанного на ПЦР-ПДРФ, для массового тестирования животных В рамках выполнения диссертационной работы нами усовершенствован способ генотипирования животных по локусу BoLA DRB3, предусматривающий амплификацию фрагмента гена размером 284 пн с использованием праймеров HLO30 и HLO32, гидролиз продуктов ПЦР рестриктазами RsaI, HaeIII, BstYI и специально подобранной для массового тестирования животных эндонуклеазой рестрикции Bst2UI (рис. 3, 4).

А В 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 3. Электрофорез в 12% полиакриламидном геле продуктов амплификации экзона 2 гена BoLA DRB3 после рестрикции BstYI, RsaI, HaeIII. А – ДНК от животного с генотипом BoLA DRB3 11*3: 1. Контрольный нерестрицированный продукт амплификации; 2. Продукт амплификации, рестрицированный рестриктазой BstY I; 3. Продукт амплификации, рестрицированный рестриктазой Rsa I; 4. Продукт амплификации, рестрицированный рестриктазой Hae III; 5. Маркер молекулярной массы (шаг маркера 50 пн). В – ДНК от животного с генотипом BoLA DRB3 22*22: 6. Контрольный нерестрицированный продукт амплификации; 7. Продукт амплификации, рестрицированный рестриктазой BstY I;

8. Продукт амплификации, рестрицированный рестриктазой Rsa I; 9.

Продукт амплификации, рестрицированный рестриктазой Hae III.

1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 4. Электрофорез в 12% полиакриламидном геле продуктов амплификации экзона 2 гена BoLA DRB3 после рестрикции эндонуклеазой Bst2UI. 1, 3, 4, 6, 8 - Bst2UI –паттерны d/f (205, 124,79, 57, 24 пн); 5 - Bst2UI –паттерны d/а (205, 111, 79, 57, 24 пн); 2 - Bst2UI –паттерны b/f (180, 80, 124, 79, 57, 24 пн); 7.- Bst2UI –паттерны d/b 9 (205, 180, 79, 24 пн); 9 – маркер молекулярных весов (длины фрагментов ДНК: 8; 11; 18; 21; 51; 57; 64; 80; 89; 104; 123; 124; 184; 192;

213; 234; 267; 434; 458; 502; 540; 587).

Анализ рестрикционной картины позволяет определить генотип животного по локусу BoLA DRB3, который записывали в виде номеров аллелей, входящих в генотип, например, 22*11 или 16*24.

3.3. Характеристика генетической структуры стад крупного рогатого скота различных пород по локусу BoLA DRB 3.

Установлено, что распределение частот встречаемости аллелей и генотипов локуса BoLA DRB3 зависит от породной принадлежности животных (табл. 3). Так, в профиле скота голштинской породы преобладают Ч-аллели, обуславливающие чувствительность (СЗАО «СКВО», ОАО «Племзавод «Кубань»); в профиле красной степной породы (ЗАОСС «Племзавод «Бейсуг») - У- (устойчивые) и Н- (нейтральные) аллели без акцентов на отдельные разновидности, у айрширской (АПФ «Нива») – Н-аллели, причм с ярко выраженной тенденцией к доминированию отдельно взятых аллелей (BoLA DRB3 *7 и *21). Как показано в таблице 3, у исследованных нами животных найдено 30 различных аллелей гена BoLA DRB3.

Сопоставление эмпирических и теоретических частот показало высокую степень достоверности наблюдаемых между ними различий.

Очевидно, что существует фактор или факторы, обуславливающие отклонение фактических частот от теоретически ожидаемых при случайном спаривании. Логично предположить, что подобное смещение вызвано давлением отбора на тот или иной признак. Для каждой из пород вектор искусственного отбора был направлен на разные качества. Так, у голштинского скота основным направлением селекции является увеличение количественных показателей молочной продуктивности. К факторам, оказывающим давление на эволюцию красной степной породы, относится, кроме того, необходимость адаптации к неблагоприятным условиям содержания и кормления. Наименьшие различия в фактических и расчетных значениях частот встречаемости аллелей наблюдались у коров айрширской породы, основное селекционное давление в которой было направлено на улучшение качественных показателей молока. Одной из причин этого, на наш взгляд, является элиминация значительного числа аллелей BoLA DRB3 у животных данной породы.

Таблица Распределение генотипов по локусу BoLA DRB 3 у животных различных хозяйств Частота встречаемости генотипов (n=823), % красная айрширГенотип по голштинская помесные животные степная ская локусу СЗАО ОАО «ПЗ ЗАО ПЗ АПФ ЗАО ЗАО «СувоBoLA DRBСКВО» «Кубань» «Бейсуг» «Нива» «Дружба» рова» (n=117) (n=417) (n=60) (n=60) (n=48) (n=121) 8*8 4,3 0,4 8,3 - - 0,1,7 2,5 2,1 - 8*16 1,7 - 2,6 1,9 - - 8*22 - - 8*24 3,4 2,3 - - 2,1 1,16*16 1,7 4,1 3,3 - - - 16*22 0,9 8,2 - - 2,1 0,16*24 2,6 7,5 - - - - 22*24 3,4 8,2 - - 4,2 0,4,3 4,9 6,3 - 22*22 - - 24*24 1,7 1,9 1,7 - - 5,Всего 26,6 41,9 15,0 0,0 16,8 9,11*8 1,7 0,8 7,8 - - 1,11*16 1,7 1,9 1,7 - 4,2 - 11*22 - 1,5 - - - - 0,9 1,9 4,2 3,11*24 1,7 - 23*8 3,4 0,8 1,7 - - 3,23*16 1,7 1,9 1,7 - - - 23*22 1,7 4,5 - - - - 23*24 4,3 5,2 1,7 - - 4,28*8 0,9 0,4 - 1,7 - - 0,9 1,1 - - 28*16 - - 28*22 - 0,4 - 1,7 - 0,28*24 - - 1,7 - - 3,Всего 17,2 20,4 18,0 3,4 8,4 16,11*11 1,7 - 6,3 - - 2,11*23 1,7 0,8 1,7 - 2,1 1,0,9 - 2,1 1,11*28 - - 23*23 1,7 1,1 - - - - 28*28 - - - 1,7 - - Всего 6,0 1,9 8,0 1,7 4,2 4,Ч/Н 28,7 25,4 15,0 20,7 35,0 24,Н/Н 13,4 4,6 23,0 55,2 18,8 29,Н/У 8,1 5,8 21,0 19,0 16,8 16,Ч/Ч генотипы Ч/У генотипы У/У генотипы Анализ распределения аллелей и генотипов позволил предположить, что определенные аллели локуса BoLA DRB3 маркируют различные хозяйственно-ценные признаки молочного скота.

Для проверки данного предположения нами проанализированы показатели молочной продуктивности по законченной первой лактации у животных ЗАО «Дружба», ЗАО «СКВО» и ЗАОСС «Племзавод «Бейсуг», разбитых на группы в зависимости от генотипа по локусу BoLA DRB3: Ч/Ч, Ч/У, Ч/Н, Н/У, Н/Н и У/У (табл. 4).

Таблица Удой коров за 305 дней лактации в зависимости от генотипа по локусу BoLA DRB Генотип по BoLA DRB Хозяйство Показатели У/У Ч/У Н/У Н/Н Ч/Ч Ч/Н частота встре4,2 8,4 16,8 18,8 16,8 35,чаемости, % ЗАО удой, кг 5547 7248 6087 6108 6105* 5960* «Дружба» M±m ±550 ±270 ±240 ±360 ±300 ± (n= 48) удой в среднем, кг частота встре6,0 17,2 8,1 13,4 26,6 28,чаемости, % ЗАО «СКВО» Ростовской удой, кг 6183* 7926 7096 6963* 7013 области M±m ±425 ±246 ±260 ±478 ±256 ±(n= 117) удой в среднем, кг частота встре8,0 18,0 21,0 23,0 15,0 15,чаемости, % ЗАОСС «Племудой, кг 5730* 6169 5885 5916 5867 5789* завод «Бейсуг» M±m ±142 ±124 ±185 ±162 ±214 ±(n= 60) удой в среднем, кг Примечание: здесь и далее: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001. Разница определена в сравнении с группой Ч/У Более детальные исследования влияния генотипов BoLA DRBпроведены в ОАО «Племзавод «Кубань». Выборка была представлена 356 коровами, молочную продуктивность которых по первой лактации оценивали по 3244 контрольным дойкам (табл. 5).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»