WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Оборудование, исходные вещества, методика эксперимента Работа выполнена с использованием хромато-масс-спектрометрических приборных комплексов GCMS 5000 Shimadzu и QP 2010 Shimadzu (Япония), включающих газовый хроматограф, многофункциональный масс-спектрометр с квадрупольным (GCMS 5000) и квадрупольно-октапольным (QP 2010) детекторами и систему обработки данных GCMS Solution. Приборы оборудованы инжектором для ввода проб с делением/без деления потока. Для разделения летучих производных использовали капиллярные кварцевые колонки DB-5MS (Supelсo) 25м0,2мм0,33мкм. ГХ анализы выполнены на газовом хроматографе НР 5890 (Hewlett Packard) c ионизационно-пламенным детектором с использованием капиллярной колонки HP-5 (Supelсo) 25м0,2мм0,33мкм.

Объектами целевого анализа были: фторуксусная кислота (ФК) и ФАН, метилфосфоновая кислота (МФК) и О-АМФК (О-изопропил МФК, О-изобутил МФК, О-пинаколил МФК), а также ТДГ.

Для подготовки проб к ГХМС анализу были разработаны подходы, основанные на жидкостной, твердофазной экстракции и твердофазной микроэкстракции. Последняя осуществлялась как в режиме отбора проб из равновесного пара, так и в режиме погружения микроволокна в пробу.

Для получения летучих производных целевых веществ использовали процедуры дериватизации, производимой в экстрактах, в сухом остатке пробы или на микроволокне.

В качестве внутренних стандартов использовали: трибутилфосфат, толуол, четыреххлористый углерод, дейтерированные О-АМФК, метафторбензойную кислоту, тиодипропанол.

Хроматографическое разделение проводили как в изотермическом режиме, так и в режиме программирования температуры. В качестве газа-носителя использовали гелий марки «А» (99,99%).

Масс-спектрометрическую регистрацию летучих производных целевых веществ осуществляли в режиме полного ионного тока (ПИТ) или селективного ионного детектирования (СИД). Масс-спектры получали в условиях электронной ионизации (ЭИ). Энергия ионизирующих электронов 70 эВ.

Объектами исследования служили: водопроводная и морская вода, почва, биологические пробы (плазма крови, гомогенаты тканей, моча) с добавками целевых веществ, пробы почвы, доставленные с объекта УХО, а также биопробы после экспонирования соответствующими токсичными соединениями цельной крови и плазмы крови человека и животных в опытах in vitro, плазма крови, моча и гомогенаты органов и тканей лабораторных животных (кроликов и крыс), полученные при интоксикации животных в опытах in vivo.

Особенности следового химического анализа в токсикологической экспертизе Целевыми веществами для химического анализа в токсикологической экспертизе могут быть как сами высокотоксичные вещества (например, фторуксусная кислота (ФК) и ее соли), так и продукты их биогенной и абиогенной трансформации: ТДГ, как основной продукт гидролиза сернистого иприта, МФК и О-АМФК, как продукты трансформации ФОВ. Анализ маркеров токсического воздействия актуален как в биологических пробах для подтверждения факта отравления и идентификации токсиканта, так и в «небиологических» пробах, через которые возможна опосредованная доставка токсичного агента в организм. Маркеры, как правило, бифункциональны, имеют гидрофильную или гидрофильно-гидрофобную природу, часто являются продуктами гидролиза и содержат в своей структуре одну, а преимущественно две и более гидроксильных групп. Такие соединения не являются традиционным объектом ГХ анализа, их дериватизация в рамках классических процедур требует особых подходов. В сложных матрицах подтверждающая идентификация, особенно в следовом анализе, является самостоятельной проблемой, не имеющей достоверного решения на основании только хроматографической информации. Последнее особенно актуально в отношении биологических проб, при анализе которых, как было подтверждено нами в модельных экспериментах, даже ГХМС в режиме СИД не обеспечивает надежной идентификации. В таких случаях требуется либо дополнительная очистка пробы, либо идентификация по полному масс-спектру.

Особенности выделения из матрицы, разделения и концентрирования нелетучих органических соединений.

Оценка возможности создания унифицированных методик Метод жидкостной экстракции находит незначительное применение для извлечения высокополярных аналитов из водных сред. Даже при использовании полярных экстрагентов и высаливающих агентов степени извлечения ФК, МФК, О-АМФК и ТДГ из водных растворов не превышают (10 – 40) %. Вместе с тем, жидкостная экстракция может быть успешно применена для очистки проб от гидрофобных примесей (очистка водных вытяжек почвы и биологических проб хлористым метиленом в анализе МФК и О-АМФК). Для анализа твердых объектов (почва, стройматериалы, биологические ткани, растертые с сульфатом натрия) может применяться экстракция ацетонитрилом в ультразвуковой ванне (извлечение МФК и О-АМФК из стройматериалов), но более эффективна экстракция щелочными водными растворами (извлечение МФК и ОАМФК из почвы, рН 10). Для подготовки к анализу нелетучих органических соединений в водных средах, к числу которых относятся не только вода, но и водные вытяжки из твердых проб и гомогенатов биологических тканей, моча, депротеинизованные кровь и плазма, классическим подходом является упаривание досуха и перерастворение в субстанциях, наиболее приемлемых для последующей дериватизации. Если дериватизация нелетучего соединения проводится в сухом остатке, а отбор летучего производного (например, этилового эфира ФК) возможен из равновесного пара, например методом ТФМЭ, характер матрицы малосущественен, и унификации поддаются все стадии анализа. ТФМЭ из равновесного пара сохраняет все преимущества ПФА, но обеспечивает существенно более высокую чувствительность. На этой основе для определения ФАН нами предложен новый унифицированный высокочувствительный способ ГХ анализа с ионизационно-пламенным и МС детектированием в воде и биологических пробах, соответственно. Способ основан на упаривании образца (воды или ацетонитрильного экстракта биопробы) досуха, этилировании сухого ос татка этиловым спиртом в присутствии серной кислоты, отборе этилового эфира ФК из равновесного пара на микроволокно с последующим ГХМС анализом.

Определены оптимальные условия для проведения ТФМЭ, а также установлено, что применение ТФМЭ для извлечения из матрицы и концентрирования аналита позволяет повысить чувствительность определения на 2 порядка в сравнении со статическим ПФА. В табл. 1 представлены результаты определения содержания ФАН в водопроводной воде методами ПФА и ТФМЭ.

Таблица 1. Результаты определения содержания ФАН в водопроводной воде методами ПФА и ТФМЭ Внесено ФАН, мг/л Найдено, мг/л ПФА ТФМЭ 10,0 10,4 ± 0,8 9,55 ± 0,5,0 4,3 ± 0,8 4,68 ± 0,0,5 5* 0,43 ± 0,0,005 5* 0,005 ± 0,*- предел обнаружения 5 мг/л В тех случаях, когда невозможен отбор летучего производного из равновесного пара, дериватизация целевых веществ проводится либо в сухом остатке, полученном после упаривания пробы или соответствующего экстракта, либо на микроволокне. В этом случае унификации подлежат отдельные стадии процедур.

Выбор режима дериватизации МФК и О-АМФК Продукты как биогенного, так и абиогенного гидролиза ФОВ - МФК и ОАМФК, методами ГХ и ГХМС могут быть определены только в виде производных. При их анализе ГХМС в режиме ионизации электронным ударом наиболее часто используют дериватизацию с получением метиловых, триметилсилиловых, а в последние годы – трет-бутилдиметилсилиловых (ТБДМС) эфиров.

Для выбора процедуры дериватизации в рамках настоящей работы было проведено сравнительное исследование эффективности дериватизации с применением трех указанных выше процедур. Интересно отметить, что в виде разных производных О-АМФК обнаруживают различный порядок выхода с хроматографической колонки со стандартной слабополярной фазой. При метилировании О-пинаколил МФК образуются четыре диастереомерные формы, которые выходят в виде 2-х пиков (группируясь парами); при силилировании МФК и ОАМФК образуются эфиры, дающие одиночные пики на хроматограмме.

При выборе процедуры получения производных во внимание принимали ее вклад в обеспечение чувствительности, селективности и воспроизводимости анализа. Выбор был сделан в пользу трет-бутилдиметилсилилирования МФК и О-АМФК с целью их последующего целевого ГХМС анализа. Характеристики, необходимые для анализа ТБДМС эфиров О-АМФК, полученные в режиме программирования температуры и при ионизации электронным ударом, приведены в табл. 2. Линейно-логарифмические индексы удерживания рассчитывали с помощью компьютерной программы в формате Q Basic.

При анализе проб биохимической природы требуются особые режимы силилирования МФК и О-АМФК с учетом биогенных компонентов плазмы крови. Нами установлено, что определению О-АМФК в плазме крови мешают 2-гидроксимасляная кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, мочевина, фосфорная кислота, 3-кeтовалериановая кислота. Введение процедуры предварительной очистки хлористым метиленом подкисленных до рН 2 экстрактов биопроб позволило снизить мешающее влияние компонентов матрицы.

Таблица 2. Масс-спектры и индексы удерживания (RI) на стандартных слабополярных фазах ТБДМС эфиров МФК и О-АМФК Соединение Масс-спектр ЭУ RI МФК 45(12), 73(55), 75(12), 135(12), 153(13), 225(11), 267(100), 268(20), 269(10), 309(5) О-изопропил МФК 45(7), 73(6), 75(20), 77(4), 121(5), 153(100), 154(10), 155(5), 195(6), 237(3) О-изобутил МФК 45(6), 57(4), 73(8), 75(19), 77(4), 121(6), 153(100), 154(10), 155(6), 193(1), 195(4), 209(3), 211(2) О-пинаколил MФК 45(8), 53(9), 55(12), 56(7), 67(8), 69(54), 73(8), 75(20), 84(19), 121(9), 153(100), 154(13), 182(7), 195(7), 211(9), 237(13).

Проведена оценка селективности определения МФК и О-АМФК в биопробах путем сравнительного анализа проб плазмы крови in vitro экспонированной метафосом (инсектицид, применяется в качестве имитатора RVX) и образцов плазмы крови in vitro экспонированных ФОВ (RVX и зоманом). Установлено, что продукты превращения метафоса (RT 26,4 – не идентифицирован, RT 29,1 - пара-нитрофенол) имеют в масс-спектре сигнал, соответствующий m/z 153 аналогично ТБДМС эфирам О-изобутил МФК (продукт метаболизма RVX) и О-пинаколил МФК (продукт метаболизма зомана) и близкое с ними время выхода на хроматографической колонке со стандартной слабополярной фазой. Проведенные исследования свидетельствуют о принципиальной возможности ошибок при диагностике поражений, вызванных антихолинэстеразными ядами (RVX, зоман, метафос) при проведении анализа методом ГХМС в режиме СИД без идентификации ТБДМС эфиров О-изобутил МФК и Опинаколил МФК по полному масс-спектру.

Проведено определение органических соединений, мешающих анализу МФК и О-АМФК в моче. Установлено, что определению О-изопропил МФК в моче человека практически не мешают компоненты матрицы. Определению МФК мешают пара-крезол (в условиях анализа хроматографически не отделяется) и 3-гидроксимасляная кислота; определению О-изобутил МФК мешает 3гидроксиизовалериановая кислота и бутандиол моноацетат (идентифицирован предположительно); определению О-пинаколил МФК – пирокатехин и фенилуксусная кислота. Применение метода ГХМС в сочетании с ТФМЭ позволило преодолеть негативное влияние матричного эффекта.

Результаты исследования зависимости степени извлечения МФК и О-АМФК при проведении ТФЭ от природы элюента Для подготовки проб к ГХМС анализу ТФЭ используется в режиме удерживания как целевых веществ, так и примесей. Для извлечения полярных органических аналитов кислотной природы наиболее эффективно применение сильных анионообменников. Катионообменники эффективны для удаления ионов металлов из водных проб, а гидрофобные сорбенты – неполярной органики. Для выделения и концентрирования МФК и О-АМФК из воды и предварительно очищенных экстракцией хлористым метиленом водных вытяжек почвы применяли ТФЭ в режиме анионообменной хроматографии с применением сильного анионообменника - силикагеля, модифицированного четвертичными аммоние выми группами (SAX). Элюат упаривали досуха. Определение МФК и ОАМФК проводили в виде силилированных производных.

В рамках указанной процедуры наиболее значимой является стадия элюирования, условия которой необходимо было оптимизировать.

При выборе элюентов руководствовались общими принципами элюирования, характерными для анионообменных процессов. В качестве элюентов были опробованы следующие реагенты:

-раствор кислоты в органическом растворителе (раствор соляной кислоты в метаноле, растворы муравьиной кислоты в метаноле и ацетонитриле);

-раствор основания в органическом растворителе (гидроксид натрия и аммиак в метаноле, диэтиламин в метаноле);

-элюент, содержащий противоион с более высокой специфической селективностью (водный раствор бромида натрия).

Положительный результат был получен только с 5 элюентами из опробованных 12 (табл. 3).

Таблица 3. Результаты тестирования различных растворов в качестве элюентов № Элюент Результат элюирования 1. 0,1 н. раствор HCl в метаноле -* 2. 0,15 н. раствор HCl в метаноле - 3. Муравьиная кислота : метанол (0,3:10) +** 4. Муравьиная кислота : ацетонитрил (0,6:10) + 5. 0,3М водный раствор NaBr - 6. 3% NH3 в метаноле 7. 1,8М раствор диэтиламина в метаноле 8. 0,1 н. NaOH в метаноле + 9. 0,5 н. NaOH в метаноле 10. 1 н. NaOH в метаноле + 11. 3% NH3 в метаноле : 1 н. NaOH в метаноле (9:1) - 12. 3% NH3 в метаноле : 25% NH3 в воде (4,5: 0,5) + * (-) - регистрируемые хроматографические пики определяемых веществ с соотношением сигнал/шум менее 3:**(+) - регистрируемые хроматографические пики определяемых веществ с соотношением сигнал/шум более 3: Основная проблема возникла при упаривании элюата досуха, так как присутствие нелетучих веществ в пробе снижало выход реакции силилирования.

Низкие степени извлечения целевых веществ, выпадение неорганического осадка, препятствующего концентрированию пробы до малого объема, заставили продолжить поиск подходящего элюента. Наиболее предпочтительным был признан элюент, содержащий 4,5 мл 3% метанольного раствора NH3 и 0,5 мл 25% водного раствора NH3. В табл. 4. представлены результаты, полученные при применении данного элюента. Параллельно для сравнения, представлены результаты опыта, в котором в качестве элюента был использован 0,1н. раствор NaOH в метаноле (лучший из ранее исследованных). В качестве внутреннего стандарта использовали трибутилфосфат, который вносили в пробу перед дериватизацией.

Существенным преимуществом выбранного элюента является отсутствие солевого осадка при упаривании элюата, который снижал бы выход реакции дериватизации с использованием N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида в качестве силилирующего агента. МФК, обладающая повышенной неспецифической сорбционной активностью, обнаруживает низкие степени извлечения, независимо от используемого элюента.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»