WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

иммобилизованные антитела к ПСАобщ, 200 мкг/мл геля (ряд 1), иммобилизованные антитела к ПСАсв, 200 мкг/мл геля (ряд 2), иммобилизованный ПСА в концентрации (ряд 3), 7 мкг/мл (ряд 4), 14 мкг/мл (ряд 5), 25 (ряд 6) мкг/мл, 55 мкг/мл (ряд 7), 80 мкг/мл (ряд 8), 160 мкг/мл (ряд 9) мкг/мл геля.

При проведении сэндвич-анализа иммобилизованный ПСА взаимодействует с проявляющими флуоресцентно-меченными антителами; при этом интенсивность флуоресцентных сигналов от соответствующих гелевых ячеек пропорциональна концентрации иммобилизованного ПСА (рис. 8).

Рисунок 8. Внутренняя калибровочная кривая — зависимость интенсивности флуоресценции гелевых ячеек от концентрации иммобилизованного на микрочипе ПСА.

Каждая точка кривой является средним из измерений на 50 микрочипах. Вертикальными отрезками показаны величины стандартных отклонений.

Полученную зависимость использовали в качестве индивидуального калибровочного графика на каждом микрочипе (внутренняя калибровочная кривая). Концентрации ПСА для иммобилизации выбирали таким образом, чтобы интенсивности флуоресцентных сигналов соответствовали диапазону флуоресцентных сигналов калибровочных кривых для ПСАобщ и ПСАсвоб, получаемых в растворе (рис. 6 и 8). Ряд 3 не содержит иммобилизованного антигена, и служит, в том числе, для контроля неспецифического связывания с гелем.

Для оценки воспроизводимости внутренней калибровочной кривой на 50 микрочипах после проведения сэндвич-иммуноанализа, получили зависимость флуоресцентного сигнала от концентрации иммобилизованного в ячейках ПСА. Концентрацию ПСА в растворе варьировали от 0 до 60 нг/мл при постоянной концентрации проявляющих антител. Величина флуоресцентного сигнала от ячеек с иммобилизованным антигеном не зависела от концентрации антигена в растворе, коэффициент вариации для всех концентраций иммобилизованного антигена не превышал 10% (рис. 8).

4.3. Определение значений «эффективных» концентраций для внутренней калибровочной кривой Для проведения количественного анализа на микрочипе с внутренней калибровочной кривой необходимо было соотнести флуоресцентные сигналы от ячеек, содержащих иммобилизованный антиген с сигналами, получаемыми от гелевых элементов с иммобилизованными антителами. Для этого флуоресцентные сигналы, полученные от ячеек с иммобилизованным антигеном, сравнивали с сигналами калибровочных кривых для ПСА в растворе (см. рис. 6 и 8), и каждой из ячеек с иммобилизованным антигеном присваивали значение «эффективной» концентрации, соответствующей данному сигналу, полученному от антигена в растворе. Было показано, что отнесение сигналов и определение «эффективных» концентраций можно производить один раз для большой (100 и более) партии микрочипов, и далее данные «эффективные» концентрации использовать при проведении анализа на каждом микрочипе этой партии.

4.4. Получение результатов иммуноанализа Определение концентрации ПСАобщ в образце с использованием внутренней калибровочной кривой показано на рис. 9. После измерений интенсивности флуоресцентных сигналов гелевых элементов с иммобилизованными антителами против ПСАобщ (ряд 1 на рис. 9 ) и элементов внутренней калибровочной кривой (ряды 3–9 на рис. 7), строили зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации ПСА с использованием предварительно полученных «эффективных» концентраций для ПСАобщ, по которой рассчитывали концентрацию ПСАобщ в образце (пунктирная линия на рис. 9 ).

Рисунок 9. Получение результатов анализа ПСАобщ с помощью внутренней калибровочной кривой на микрочипе. На диаграмме показаны флуоресцентные сигналы от гелевых элементов с иммобилизованными антителами против ПСАобщ (ряд 1), сигналы внутренней калибровочной кривой (ряды 3–9) и «эффективные» концентрации, рассчитанные для ПСАобщ. В данном образце [ПСАобщ] = 37 нг/мл.

Определение концентрации ПСАсв проводили аналогичным образом по интенсивности флуоресценции гелевых элементов с иммобилизованными антителами против ПСАсвоб (ряд 2 на рис. 7) и «эффективным» концентрациям, рассчитанным для ПСАсвоб.

Для обработки результатов иммуноанализа на микрочипах была специально разработанна программа «ImaGelAssay» (ИМБ РАН). Программа регистрирует флуоресцентные сигналы от гелевых ячеек биочипа, строит калибровочные кривые по «эффективным» концентрациям и сигналам, полученным от ячеек с иммобилизованным антигеном. Затем по сигналам от ячеек с иммобилизованными антителами программа автоматически определяет концентрации двух форм ПСА и их соотношение в исследуемом образце.

4.5. Определение содержания двух форм ПСА в сыворотках крови С использованием микрочипов с внутренней калибровочной кривой и программы «ImaGelAssay» проведено определение концентраций двух форм ПСА в сыворотках крови доноров и больных раком предстательной железы. В качестве референсых значений использовали концентрации двух форм ПСА, определенные методом ИФА с использованием диагностических наборов фирмы CanAg (Швеция). Результаты измерений 17 сывороток в двух системах приведены на рис. 10 а,б.

Рисунок 10. Сравнение результатов анализа общей (а) и свободной (б) форм ПСА на микрочипах, содержащих внутреннюю калибровочную кривую, с результатами ИФА, полученными при использовании набора фирмы CanАg (Швеция).

Как видно из рисунка, полученные данные хорошо коррелируют между собой:

коэффициент корреляции составил r = 0.988 для общей формы ПСА и r = 0.987 для свободной формы ПСА.

5. Стабильность микрочипов с иммобилизованными антителами и ПСА Иммобилизация в геле способствует стабилизации белков. В особенности это важно для ПСА, который является ферментом и, как известно, плохо хранится в растворе.

Микрочипы с иммобилизованными антителами и ПСА хранили при +2 – 8°С. В данной работе были получены калибровочные кривые от антигена в растворе и внутренние калибровочные кривые на свежеизготовленных микрочипах и микрочипах, после хранения в течение года. Флуоресцентные сигналы в обоих случаях находились в пределах допустимых значений разброса (К.В. 10%). Минимально определяемая концентрация антигена не менялась в зависимости от хранения микрочипов.

Рисунок 11. Стабильность микрочипов с иммобилизованными антителами и ПСА. (а) Внутренняя калибровочная кривая. Флуоресцентные сигналы гелевых ячеек получены на биочипах непосредственно после изготовления (1) и после хранения биочипов в течение месяцев при 2–8оС (2). (б) Калибровочные кривые сэндвич-иммуноанализа общей формы ПСА, полученные на контрольных микрочипах (хранение в течение суток) (1) и после хранения в течение 6 месяцев при 2–8оС (2).

Подобранный нами состав гелеобразующих мономеров, в который входят производные аминосахаров, препятствует дегидратации сформированных гелевых элементов при хранении микрочипов, что также способствует сохранению исходных свойств иммобилизованных белков.

ВЫВОДЫ 1. Подобраны оптимальные условия иммобилизации белков в гелевых элементах микрочипов с максимальным сохранением исходной активности белков.

2. Разработан биологический микрочип для количественного анализа общей и свободной форм простата-специфического антигена. Подобраны условия для проведения одновременного иммуноанализа двух форм ПСА на микрочипе.

3. Показана возможность проведения количественного анализа двух форм ПСА на биологическом микрочипе, содержащем иммобилизованные антитела и внутреннюю калибровочную кривую, иммобилизованный антиген. Разработанный метод позволяет значительно упростить процедуру анализа, проводя его в формате один микрочип – один анализ.

4. Получены основные аналитические характеристики разработанного метода:

проведена оценка воспроизводимости и чувствительности иммуноанализа двух форм ПСА на микрочипе. Результаты полностью удовлетворяют требованиям, предъявляемым к иммунологическим аналитическим системам.

5. Показано, что результаты измерений содержания в сыворотках крови ПСАобщ и ПСАсв на биочипах коррелируют с результатами, полученными в стандартных тестсистемах.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. A.Yu. Rubina, E.I. Dementieva, A.A. Stomakhin, E.L. Darii, S.V. Pan’kov, V.E.

Barsky, S.M. Ivanov, E.V. Konovalova, and A.D. Mirzabekov. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. //Biotechniques 34: 1008–1022 (May 2003) 2. Е.В. Коновалова, А.Ю. Рубина. Разработка метода иммуноферментного анализа на гелевых микрочипах. Тезисы докладов и стендовых сообщений ХVI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва, 9-12 февраля 2004г. С. 86-87.

3. Т.П. Рябых, Т.В. Осипова, Е.И. Дементьева, Е.Н. Савватеева, Е.В. Коновалова, А. Соколова, А.Ю. Рубина, А.Ю. Барышников, А.С. Заседателев. Тест-система в формате биочипа для одновременного количественного определения общей и свободной форм простата-специфического антигена в сыворотке крови. //Российский биотерапевтический журнал, 2006, № 1, Т. 5, С. 49-57.

4. Т.П. Рябых, Т.В. Осипова, Е.И. Дементьева, Е.Н. Савватеева, Е.В. Коновалова, А. Соколова, А.Ю. Рубина, А.Ю. Барышников, А.С. Заседателев. “Разработка диагностической тест-системы на основе биочипа на простатический специфический антиген (общую и свободную формы)”. Российский биотерапевтический журнал, 2006, № 1, Т. 5, С. 10.

Коновалова Елизавета Владимировна Разработка количественного анализа серологических маркеров рака предстательной железы на гидрогелевых микрочипах Подписано в печать 19.10.06. Формат 60х84 1/16. Печать офсетная.

Усл.печ.л.1,0. Уч.-изд.л.1,0 Тираж 60 экз. Заказ № ф- Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский физико-технический институт (государственный университет) Отдел автоматизированных издательских систем "ФИЗТЕХ-ПОЛИГРАФ" 141700, Моск.обл., г.Долгопрудный, Институтский пер.,

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»