WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Оказалось, что через 50 мин облучения пероксидазы УФ-света с длиной волны 312 нм теряется более 90% активности.

Необходимо было подобрать более мягкие условия изготовления микрочипов. Для этого: (1) использовали УФ излучение с максимумом 350 нм при полимеризации, (2) полимеризацию производили при охлаждении, чтобы температура полимеризационной смеси не превышала 20оС, (3) уменьшили время полимеризации до 50 мин, (4) вводили в гель сахарозу в качестве стабилизирующей добавки (от 10 до 60%). Сигналы, получаемые от иммобилизованной пероксидазы в выбранных нами условиях, были в 20–30 раз выше, чем в стандартных условиях изготовления ДНК-микрочипов. Известно, что сахара препятствуют дегидратации и способствуют стабилизации белков. Поэтому в дальнейшем в работе использовали гели на основе мономеров, производных метакриламида и аминосахаров.

Для измерения сохранения активности пероксидазы после иммобилизации на микрочипе в выбранных условиях, фермент иммобилизовали на микрочипе в разных концентрациях (10–60 мкг/мл геля). Получили зависимость интенсивности хемилюминисцентного сигнала гелевых эелементов от концентрации иммобилизованной пероксидазы. По этим данным рассчитали удельную активность фермента (с учетом эффективности иммобилизации). Для измерения активности пероксидазы, не подвергающейся влиянию иммобилизации, фермент сорбировали на пустых гелевых элементах; ферментативную активность определяли как интенсивность хемилюминесценции гелевых элементов после добавления субстрата (люминол и перекись водорода). Удельная ферментативная активность сорбированной пероксидазы составила 105 отн.ед., после иммобилизации 7·104 отн.ед. Таким образом, после иммобилизации фермент сохранил около 70% активности.

В результате были подобраны условия ковалентной иммобилизации белков в геле с сохранением ими биологической активности.

2.3 Выбор состава геля для проведения иммуноанализа на гелевых белковых микрочипах на примере прямого анализа ПСА Необходимо было выбрать состав геля, обладающий достаточной пористостью для проникновения антигена и образования бинарного комплекса антитело-антиген.

Технология изготовления трехмерных гелевых микрочипов позволяет создавать гели различной пористости, необходимой для проведения анализа разных типов биомолекул.

для иммобилизации антител.

Для выражения состава геля используют обозначения Т(%) – суммарная масса всех гелеобразующих мономеров к объему геля, и С(%) – вес сшивки к суммарному весу всех гелеобразующих мономеров. Известно, что повышение пористости геля возможно достичь за счет уменьшения концентраций гелеобразующих мономеров (Т %). В то же время, размер пор также сильно зависит от концентрации добавляемого в раствор мономера “сшивающего” агента (С %). В случае акриловых полимеров эта зависимость имеет вид кривой с минимумом при концентрации сшивки около 5% [И.В.Березин, 1987].

Мы исследовали влияние процентного содержания мономера и сшивки на пористость получаемых гелей. Для этого изготовили микрочипы с гелями различного состава, содержащими иммобилизованые антитела к ПСА в равных концентрациях. На этих микрочипах были получены кинетические кривые образования бинарного комплекса флуоресцентно меченного ПСА-Су5 с моноклональными антителами (рис. 3). Раствор флуоресценто-меченного антигена в PBS (фосфатно-солевой буфер, 0.15 М NaCl, рН 7.2), содержащем 0.15% поливинилового спирта и 0.15% поливинилпирролидона, наносили на микрочипы, и регистрировали рост флуоресцентного сигнала на гелевых ячейках микрочипа с течением времени. Во всех гелях в качестве основного мономера использовали 2-метакриламидо-2-дезокси-D-глюкозу, в качестве сшивающего агента N,N-метиленбисакриламид.

Рисунок 3. Кинетические кривые образования бинарного комплекса ПСА-Су5 с антителами к ПСА (0.6 мг/мл в геле), иммобилизованными в гелях состава T3%C2.5% (1), T4%C2.5% (2), T3%C25% (3), T5%C4% (4) и T6%C5% (5). Концентрация антигена в буфере PBS 100 нг/мл. Т= 20°С.

Как видно из рисунка, максимального флуоресцентного сигнала удается достичь при использовании композиции Т3%С2.5%, минимальный сигнал был получен от ячеек с гелем T6%C5%. Эффективность иммобилизации антител во всех гелях была примерно одинакова и составляла 30-40%. Таким образом установили, что гель с минимальной концентрацией мономеров и сшивки обладал наибольшей пористостью, что согласуется с данными, известными для акриловых полимеров. В дальнейшей работе для изготовления микрочипов был выбран гель состава Т3%С2.5%.

2.4. Сравнение двумерных и трехмерных микрочипов Для изготовления белковых микрочипов используются различные технологии, в большинстве случаев белки закрепляют (за счет физической сорбции или ковалентно) на поверхности твердых носителей; такие микрочипы являются ‘двумерными’.

Чтобы сравнить трехмерную гелевую поверхность с двумерной, были изготовлены микрочипы, содержащие антитела к ПСА, иммобилизованные в различных концентрациях. Для получения двумерных чипов поверхность стеклянных слайдов обрабатывали реагентом (3-глицидилоксипропил)-триметоксисиланом. Эпоксидирование слайда даёт возможность получать спейсер, отделяющий белок от носителя, это имеет значение для уменьшения потери исходной активности белка за счет стерических затруднений, возникающих в процессе иммобилизации. В качестве трехмерных микрочипов использовали гелевые микрочипы, изготовленные по технологии, описанной выше.

Микрочипы инкубировали с раствором ПСА (в различных концентрациях), после инкубации промывали 20 мин PBS, содержащим 0.1% Tween-20, и проявляли антителами, специфичными к другому эпитопу, меченными Су-5 (15 мкг/мл), в течение 2 ч.

Регистрацию сигналов проводили при помощи флуоресцентного микроскопа. Для двух типов микрочипов были получены графики зависимости интенсивности флуоресцентных сигналов от концентрации антигена (ПСА) в растворе (рис.4).

Рисунок 4. Зависимость интенсивности флуоресцентных сигналов от концентрации ПСА в растворе в случае трехмерных (а) и двумерных (б) микрочипов. Концентрации иммобилизованных антител к ПСА в ячейках микрочипов: [1] – 220мкг/мл, [2] – 110мкг/мл, [3] – 50 мкг/мл, [4] – 25мкг/мл, [5] – 14мкг/мл.

Как видно из рисунка, флуоресцентные сигналы, соответствующие максимальной концентраций иммобилизованных антител в случае гелевых микрочипов на порядок превосходят сигналы от аналогичных ячеек двумерных микрочипов. В то же время, сигналы для минимальной концентрации антител в геле превышают сигналы от иммобилизованных на двумерных микрочипах антител в четыре раза. Это можно объяснить тем, что в случае двумерных микрочипов существует зависимость эффективности иммобилизации от исходной концентрации иммобилизуемого белка; и довольно быстро наступает насыщение по количеству иммобилизованных молекул на единицу поверхности, при достижении которого не происходит дальнейшего увеличения количества иммобилизуемого соединения. Трехмерная структура геля повышает емкость иммобилизации по сравнению с поверхностным слоем, увеличивая возможное количество иммобилизуемого белка в пересчете на единицу поверхности; при этом иммобилизованные соединения равномерно распределены по всему объему геля на достаточно удаленном расстоянии друг от друга (более 1000) даже при высокой концентрации иммобилизуемых зондов [Rubina 2004]. Кроме того, иммобилизация в объеме гелевого элемента предохраняет молекулы от контакта с гидрофобной поверхностью подложки, что предотвращает денатурацию белков. Все это позволяет получить более высокую чувствительность анализа на гелевом микрочипе, по сравнению с двумерными микрочипами.

3. Определение констант ассоциации (Kass) бинарного комплекса флуоресцентно меченного ПСА с иммобилизованными на микрочипе моноклональными антителами При выборе антител важной характеристикой является их аффинность, характеризующаяся константой ассоциации. На микрочипах были измерены константы ассоциации для антител, специфически связывающих общую(PSA-36) и свободную(PSA30) формы ПСА.

Для определения константы ассоциации образования бинарных комплексов ПСА, меченного флуоресцентным красителем Су-5 с иммобилизованными антителами к свободной и общей форме, на микрочипах получили зависимость интенсивности флуоресцентных сигналов от концентрации ПСА-Су5 в растворе. Из полученных данных рассчитали Kass антигена с антителами (по формуле 1).

Рисунок 5. Определение константы ассоциации (Kass) образования бинарных комплексов между ПСА-Су5 и иммобилизованными на микрочипе антителами PSA-30 и PSA-(200 мкг/мл в геле). Сигналы Iфлуор для разных концентраций ПСА измерены в насыщении.

1 1 1 = + (1), I Kass[Ab0] [Ag0] [Ab0] где I — интенсивность флуоресцентного сигнала; – коэффициент пропорциональности;

[Ab0] — общая концентрация иммобилизованных антител в геле, [Ag0] — общая концентрация антигена в растворе. Более подробное описание расчета констант ассоциации представлено в [Rubina A. Yu. 2005].

График зависимости интенсивности сигнала от концентрации антигена в растворе, представленный в двойных обратных координатах, можно аппроксимировать в виде 1 прямой линии с углом наклона, пересекающей ось ординат в точке.

Kass[Ab0 ] [Ab0 ] Значение константы ассоциации может быть рассчитано из соотношения Kass= - в [Ag0] точке = 0.

I Расчётная константа ассоциации для флуоресцентно-меченного ПСА и антител PSA-к общей форме составила (1.5±0.4)*108 М-1, для антител PSA-30 к свободной форме (1.1±0.4)*108 М-1. Полученные значения констант соответствуют значениям для данных антител, известных от производителей, что говорит об иммобилизации антител без потери биологической активности.

4. Белковый гидрогелевый микрочип для количественного анализа двух форм ПСА Основной задачей данной работы являлось создание аналитической системы для одновременного количественного определения двух форм ПСА на основе гидрогелевого микрочипа. На первом этапе необходимо было создать микрочип с иммобилизованными антителами и оптимизировать процедуру анализа на микрочипе.

Известно, что наиболее чувствительным из возможных типов иммуноанализа является сэндвич-иммуноанализ. Сэндвич-вариант иммуноанализа возможен, если использовать антитела, специфичные к разным эпитопам белковой молекулы. В случае сэндвич-иммуноанализа микрочип содержит иммобилизованные антитела, реакционная среда (образец) содержит антиген, и на первой стадии происходит образование специфического бинарного комплекса антиген-иммобилизованное антитело. После образования комплекса микрочип обрабатывают проявляющими флуоресцентно-меченными антителами, специфичными к другому эпитопу анализируемого антигена. Чем выше концентрация анализируемого соединения в образце, тем выше сигнал, регистрируемый с соответствующих гелевых ячеек микрочипа. В результате получают график зависимости флуоресцентного сигнала гелевых элементов, содержащих антитела, от концентрации антигена в растворе (калибровочную кривую), по которой далее определяют неизвестную концентрацию антигена в исследуемом образце.

Для иммобилизации были выбраны моноклональные антитела против свободной формы ПСА (PSA-30) и общей формы ПСА (PSA36); в качестве проявляющих антител выбрали PSA66 фирмы CanAg (Швеция). Антитела PSA30 специфичны к участку сайта связывания ПСА с антихимотрипсином, антитела PSA-36 специфичны к открытому участку ПСА, общие проявляющие антитела PSA-66 специфичны к другому открытому участку ПСА. Иммуноанализ проводили следующим образом: микрочипы после полимеризации отмывали в 0.01 М фосфатном буфере, рН 7.2, содержащем 0.15 М NaCl (PBS) и 0.1% Tween-20, и затем дистиллированной водой. Для уменьшения неспецифических взаимодействий микрочипы обрабатывали блокирующим раствором:

1% поливинилового спирта (ПВС) в PBS, в течение 40 мин, затем промывали дистиллированной водой и наносили 30 мкл образца. Далее микрочипы инкубировали в течение 17 ч при 22-25°С. После инкубации микрочипы промывали 20 мин PBS, содержащим 0.1% Tween-20, и проявляли антителами PSA-66, меченными Су-5 (мкг/мл), в течение 2 ч.

Регистрацию и расчет интенсивности флуоресцентного сигнала проводили с помощью программного обеспечения ImaGelAssay; при анализе полученных данных интенсивность флуоресценции рассчитывали как медианный сигнал от четырех одинаковых гелевых ячеек.

4.1. Характеристики количественного иммуноанализа ПСА на биочипах На микрочипах, содержащих иммобилизованные антитела против ПСАобщ и ПСАсвоб была проведена оценка воспроизводимости измерений и чувствительности метода.

Для оценки воспроизводимости в серии экспериментов на 100 микрочипах получили графики зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации антигена в растворе (рис. 6). Рабочий диапазон концентраций для определения ПСАобщ составляет 0,3 – нг/мл, для ПСАсв — 0,2 – 20 нг/мл. Коэффициент вариации (К.В.), значение которого определяли как отношение стандартного отклонения к средней величине флуоресцентного сигнала, выраженное в процентах, для различных концентраций определяемого антигена находился в интервале 7–10 % для серии из 10 калибровочных кривых, что свидетельствует о хорошей воспроизводимости анализа ПСА на микрочипах.

Рисунок 6. Сэндвич-иммуноанализ ПСА на микрочипах. Зависимость интенсивности флуоресценции гелевых ячеек микрочипа, содержащих иммобилизованные антитела против ПСАобщ (а) и ПСАсвоб (б), от концентрации ПСА в растворе. Вертикальными отрезками показаны величины стандартных отклонений. На вставках к рис. (а) и (б) приведены начальные участки соответствующих кривых. На осях ординат показаны значения интенсивности флуоресценции нулевой пробы, I0, а также I0 плюс два стандартных отклонения (I0 + 2SD).

Чувствительность анализа, т.е. наименьшую определяемую концентрацию ПСА, рассчитывали как концентрацию, соответствующую значению флуоресценции, превышающему не менее чем на два стандартных отклонения флуоресцентный сигнал многократно измеренной (более 10 раз) нулевой калибровочной пробы, не содержащей анализируемого соединения. Чувствительность определения для ПСАобщ составила 0,нг/мл, а для ПСАсв – 0,2 нг/мл (рис. 3в, 3г). Результаты по воспроизводимости и чувствительности полностью удовлетворяют требованиям, предъявляемым к иммунологическим аналитическим системам.

2.5. Внутренняя калибровочная кривая Для определения концентрации двух форм ПСА в образце в одном анализе в состав микрочипа, помимо гелевых ячеек с иммобилизованными антителами, были введены ячейки, содержащие иммобилизованный антиген (ПСА) в различных концентрациях.

Структура микрочипа с внутренней калибровочной кривой приведена на рис. 7.

Рисунок 7. Флуоресцентное изображение гелевых ячеек микрочипа для количественного определения двух форм ПСА после проведения иммуноанализа. Структура микрочипа:

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»