WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Для проведения в дальнейшем препаративного разделения смесей стильбеноидов были выполнены дополнительные исследования их адсорбционных взаимодействий с аэросилом в широкой области концентраций. Проведено сравнение адсорбционных констант стильбеноидов, измеренных методом НФ ВЭЖХ в области малых концентраций, с результатами, полученными статическим методом при измерении изотерм адсорбции в области больших концентраций. Обнаружено, что в некоторых случаях величины предельной адсорбции исследованных соединений, рассчитанные по уравнению Ленгмюра для мономолекулярной адсорбции на поверхности с энергетически однородными центрами, совпадают (например, для транс-4-гидроксистильбена), а в некоторых случаях (например, для фенола) значительно отличаются от величин равновесной адсорбции, оцененных по области выхода изотерм адсорбции на плато.

Лучшие результаты дает использование уравнения Фрейндлиха для локализованной адсорбции на поверхности с энергетически неоднородными центрами.

На рис. 4 приведены результаты измерений изотерм адсорбции, обработанные в координатах уравнения Фрейндлиха:

lg(a) = n+m•lg(Cp), (4) где а – величина адсорбции, Cp – равновесная концентрация соединения в растворе, n и m – эмпирические коэффициенты, зависящие от природы сорбируемого вещества.

Значения констант n и m уравнения (4), рассчитанные из экспериментальных изотерм адсорбции на кремнеземе из смеси н-гексана и этилацетата, приведены в табл. 8.

A, мкмоль/м2 lg (A), мкмоль/ма 3' б 3' 0.1.0.-0.1.-1.-1.0.-2.-2.0.0 -3.10 20 30 40 50 -1.2 -0.6 0.0 0.6 1.2 1.8 2.С, ммоль/л р lg (С ), ммоль/л р Рис. 4. Изотермы адсорбции: а - фенола (1), транс-4-гидроксистильбена (2), резвератрола (3), флороглюцина (4) и пицеатаннола (5) из смеси н-гексана и этилацетата (1:1) на поверхности SiO2 и резвератрола (3`) на поверхности Al2O3; б – изотермы тех же соединений в координатах уравнения Фрейндлиха.

Как было показано методом ИК-Фурье-спектроскопии (рис. 5), адсорбция стильбеноидов осуществляется на силанольных группах поверхности кремнезема с образованием водородных связей и полностью обратима.

Таблица 8 Уменьшение числа ОН-групп в Значения констант n и m в уравнении молекуле стильбеноида от четырех Фрейндлиха, рассчитанные из (пицеатаннол) до одной (4экспериментальных изотерм адсорбции на гидроксистильбен) существенно не кремнеземе из смеси н-гексана и этилацетата влияет на механизм взаимодействия (1:1). стильбеноидов с аэросилом. Однако Соединение n m при этом уменьшается величина транс-4-Гидроксистильбен -1.69 0.адсорбции стильбеноида на Резвератрол -0.82 0.кремнеземе и часть силанольных Пицеатаннол -0.63 0.групп поверхности остается Фенол -1.84 0.свободной.

Флороглюцин -0.75 0.Оксид алюминия, также как и силикагель, широко используется в колоночной хроматографии низкого давления при анализе фармацевтических препаратов.

Оксид алюминия проявляет повышенную селективность по A 3395 а сравнению с силикагелем в | / 1870 / разделении полиенов и - | 3740 1988 / / каротиноидов. Изучено влияние | / химии поверхности адсорбента на - | величину адсорбции | гидроксистильбенов. Для сравнения - | 3740 3476 / б использовался пирогенный аэрогель | / 1870 / Al2O3 фирмы Degussa (AluC, Sуд = - | 1988 / м2/г).

| / Обнаружено, что величина ад- | сорбции транс-4-гидроксистильбена ||_| _ _|_ _ | _| и резвератрола на поверхности SiO- 4000 3200 2400 1800 1400см при выходе на плато составляет 0.и 0.74 мкмоль/м2 (рис. 4, кривая 2 и Рис. 5. ИК-спектры диффузного отра3), а на Al2O3 – 0.44 и 1.5 мкмоль/мжения кремнезема, модифицированного (кривая 3`), соответственно, т.е. на пицеатаннолом (а), и чистого кремнезема Al2O3 величина адсорбции гидрокси(б).

стильбена и резвератрола на единицу поверхности примерно в 2 раза больше, чем на SiO2. Константы n и m уравнения Фрейндлиха для транс-4гидроксистильбена и резвератрола на SiO2 составили соответственно значение -1.и 0.81, а на Al2O3 соответственно, -0.61 и 0.72.

Сравнение значений констант n и m для стильбенов и фенолов, приведенных в табл. 8, позволяет обнаружить корреляцию между адсорбционным поведением фенола и транс-4-гидроксистильбена, а также флороглюцина, резвератрола и пицеатаннола. Полученный результат важен для препаративного разделения стильбеноидов, поскольку многие соединения этого ряда малодоступны и дороги.

Возможность прогнозирования хроматографического поведения стильбеноидов в конкретной системе, путем изучения хроматографического поведения легко доступных и дешевых гидрокси- и метокси производных бензола и дифенила, имеет большое значение для практических целей препаративного разделения растительных стильбеноидов.

Глава 6 посвящена применению установленных закономерностей хроматографического поведения стильбеноидов с различной функциональностью для решения практических задач по оптимизации условий анализа и препаративного разделения смесей стильбеноидов, а также контроля за качеством лекарственных препаратов.

Значительно ускорить проведение препаративного разделения растительных экстрактов и смесей синтезированных стильбеноидов позволяет использование корреляции между параметрами удерживания стильбеноидов, полученных методами ТСХ и НФ ВЭЖХ.

На рис. 6 приведена линейная зависимость между величиной обратной константе Rf и удельным удерживаемым объемом Vrm стильбеноидов в изократическом режиме элюирования, которая может быть описана уравнением:

1/Rf = 0.06+1.44 Vrm. (5) Ошибка переноса данных между двумя методами меньше 10%.

1/Rf 5 13 0 2 4 6 Vrm Рис. 6. Зависимость между величиной обратной константе Rf и приведенным объемом удерживания Vrm (мкл/мг) для цис-стильбена (1), транс-стильбена (2), метоксибензола (3), 4,4`-диметоксидифенила (4), 1,4-диметоксибензола (5), транс4-метоксистильбена (6), транс-4,4`-диметоксистильбена (7), фенола (8), транс-4гидроксистильбена (9), пирокатехина (10), резорцина (11), 1,4-дигидроксибензола (12), резвератрола (13), флороглюцина (14), пицеатаннола (15) при значении этилацетата в н-гексане: 50%.

Линейные зависимости наблюдаются для всех стильбеноидов в широком диапазоне изменения концентрации полярного модификатора в бинарном элюенте.

В частности, на рис. 7 приведены данные для пицеатаннола и рапонтигенина.

1/Rf Рис.7. Зависимость между константой Rf и удельным 9 удерживаемым объемом Vrm (мкл/мг) для пицеатаннола и 3 рапонтигенина при значениях 4' этилацетата в н-гексане: 80% (1,1, 3' соответственно), 70% (2, 2), 60% (3, 3), 50 % (4, 4).

2' 1' 0 2 4 Vr m Кроме того, были проведены исследования взаимосвязи между параметрами хроматографического удерживания, полученными методами НФ и ОФ ВЭЖХ, для использования сформированного нами массива данных при анализе биологических жидкостей. К тому же использование в качестве твердой фазы гидрофобного силикагеля С18 позволяет в первом приближении моделировать липидный матрикс биомембран и прогнозировать поведение стильбенсодержащих лекарственных препаратов в живых системах.

Были измерены зависимости между значениями факторов удерживания стильбеноидов, полученными методами НФ ВЭЖХ (Силасорб-600, элюент – смесь этилацетата и н-гексана (1:1) и ОФ ВЭЖХ (Hypersil ODS С18, колонка 1254 мм, диаметр зерна 3 мкм; элюент – смесь ацетонитрила и воды (1:1). Обнаружено, что существует линейная зависимость между этими хроматографическими параметрами. В табл. 9 проведено сравнение параметров разделения стильбеноидов в НФ ВЭЖХ и ОФ ВЭЖХ в изократическом режиме элюирования. Величины значений a и R между пиками для большинства стильбеноидов одинаковы в обоих методах кроме изомеров стильбена. Численные значения величин a и R при разделении смеси изомеров стильбена в 2 и 10 раз больше при использовании метода НФ ВЭЖХ, чем ОФ ВЭЖХ. По-видимому, это связано со специфическим взаимодействием изомеров стильбена с поверхностью гидроксилированного силикагеля.

Результаты исследования хроматографических параметров удерживания стильбеноидов и установленные корреляционные зависимости позволяют прогнозировать их поведение при изменении условий сорбции, а также оптимизировать условия хроматографического разделения смесей стильбеноидов.

Полученные результаты могут оказаться очень полезными при выборе метода анализа стильбеноидов и перенесении параметров хроматографического разделения между методами НФ ВЭЖХ или ОФ ВЭЖХ.

Таблица Хроматографические параметры удерживания и разделения смеси стильбеноидов в условиях НФ и ОФ ВЭЖХ Соединеие Силасорб-600 Hypersil ODS СK R k R a a цис-Стильбен 0.08 2 3.75 16.11 1.03 0.транс-Стильбен 0.19 16.транс-4-Метоксистильбен 2.11 1.15 3.33 15.71 1.11 2.транс-4,4`- 2.42 14.Диметоксистильбен транс-4-Гидроксистильбен 3.36 1.36 3.67 4.92 1.32 2.Диэтилстильбэстрол 4.56 3.Резвератрол 6.78 1.34 7.61 2.12 1.15 6.Пицеатаннол 9.09 1.k - фактор удерживания, a - фактор разделения и R - разрешение между пиками соединений.

Хроматографический метод анализа широко используется для контроля качества фармацевтической и косметической продукции. Использование сформированного массива данных по хроматографическому удерживанию стильбеноидов позволяет быстро и надежно идентифицировать присутствие этих ценных биологически активных веществ, обладающих пртивораковой, антивирусной, гепато- и кардиопротекторной активностью в фармакологической и косметической продукции.

На основе экстрактов древесины Маакии амурской, стеблей Vitis amurensis и корневищ Rhei undulati, содержащих смесь стильбеноидов (пицеатаннола, рапантигенина, резвератрола и др.), изготавливается ряд лекарственных и косметических препаратов, а также биологически активных добавок. На рис. 8-приведены хроматограммы экстракта из древесины Маакии амурской и препарата «Максар», производимого на его основе, зарегистрированного как биологически активная добавка. Пики на хроматограмме препарата «Максар» идентифицировали с использованием двух параметров: времени удерживания и спектрального отношения при длинах волн 280 нм и 365 нм. В обоих образцах обнаружены резвератрол, рапонтигенин и пицеатаннол.

Экспериментально было установлено, что оптимальная объемная концентрация этилацетата в н-гексане для разделения стильбеноидов с гидрокси- и метоксигруппами составляет 50%. Эта система оказалась пригодной для анализа растительных экстрактов методом НФ ВЭЖХ.

Таким образом, использование метода НФ ВЭЖХ и сформированного массива данных по хроматографическому удерживанию стильбеноидов позволяет надежно определять наличие стильбеноидов в растительных экстрактах, контролировать качество лекарственных препаратов и значительно сократить время анализа.

Рис. 8. Хроматограмма I, m V препарата «Максар»: резвератрол (1), рапонтигенин (2) и пицеатаннол (3) в системе Силасорб 600 – этилацетат – нгексан при объемной концентрация 1 этилацетата в н-гексане = 50%.

0 350 700 1050 1400 1750 V, м к л Рис. 9. Хроматограмма соединений из древесины Маакии амурской: резвератрол (1), рапонтигенин (2) и пицеатаннол (3), 30 кверцетин (4) и морин (5) в системе Силасорб 600 – этилацетат – нгексан при объемной концентрация этилацетата в н-гексане = 50%.

0 350 700 1050 1400 1750 V, мкл В состав многих лекарственных препаратов, используемых в гормонозаместительной терапии, входят соединения со структурой стильбена. На рис. 10 приведена хроматограмма препарата «Фолликулин», зарегистрированного в реестре лекарственных препаратов РФ, в состав которого входят эстрогенные гормоны нестероидного строения – димэстрол, синэстрол и октаэстрол.

I, m V б I, m V а 0 100 200 300 400 500 600 700 800 0 100 200 300 400 500 600 700 800 V, м к л V, м к л Рис. 10. Хроматограммы: (а) смеси стандартов – димэстрола (1), синэстрола (2) и октаэстрола (3); (б) препарата «Фолликулин» (Силасорб 600 – этилацетат – н-гексан при объемной концентрация этилацетата в н-гексане = 50%).

Как показывает сравнение хроматограмм, в препарате «Фолликулин» содержатся вышеупомянутые эстрогенные соединения, что подтверждает заявленный состав данного препарата.

Для экспресс-анализа биологических жидкостей, содержащих лекарственные препараты на основе эстрогенных гормонов нестероидного строения, могут быть использованы корреляционные зависимости между параметрами удерживания, полученными методами ТСХ и НФ ВЭЖХ для фенольных соединений.

В табл. 10 приведены значения Rf и Vrm эстрогенных гормонов нестероидного строения. Как видно из таблицы, значения удельных удерживаемых объемов Vrm, для эстрогенных гормонов нестероидного строения, полученные экспериментально и рассчитанные по уравнению (5), хорошо согласуются между собой.

Таблица Значения констант Rf и удельных удерживаемых объемов Vrm, для эстрогенных гормонов нестероидного строения Vrm, Vrm, Соединение Структура Rf (рассчитанное) (экспериментальное) транс-3,4-Ди-(4- 0.1.19±0.06 1.14±0.OMe метоксифенил)-3-гексен MeO (димэстрол) транс-3,4-Ди-(4- 0.1.61±0.08 1.59±0.OH гидроксифенил)-3- HO гексен (диэтилстильбэстрол) мезо-3,4-Ди-(4- 0.1.47±0.07 1.42±0.OH гидроксифенил)-гексан HO (синэстрол) мезо-2,4-Ди-(4- 0.1.66±0.08 1.65±0.OH OH гидроксифенил)-3этилгексан (октэстрол) Таким образом, обнаруженные зависимости, связывающие параметры удерживания стильбеноидов, полученные различными методами жидкостной хроматографии, значительно облегчают оптимизацию условий анализа и препаративного разделения смесей стильбеноидов, позволяют прогнозировать поведение стильбеноидов при изменении условий сорбции, а также контролировать качество лекарственной и косметической продукции.

ВЫВОДЫ 1. Получены новые экспериментальные данные о хроматографических свойствах синтетических и растительных стильбеноидов в условиях нормально фазовой жидкостной хроматографии на кремнеземе. Сформирован массив данных в виде зависимостей удерживания стильбеноидов от доли полярного модификатора в элюенте для качественного и количественного анализа растительных экстрактов и фармацевтических препаратов, содержащих стильбеноиды.

2. Установлены зависимости хроматографического удерживания стильбеноидов от физико-химических свойств их молекул (функциональности, количества и положения функциональных групп, геометрической конфигурации и длины олефинового фрагмента). Определены количественные соотношения вкладов этих составляющих в хроматографическое удерживание.

Изучены возможности моделирования стильбеноидов с использованием производных бензола и дифенила с аналогичной функциональностью и пространственным расположением групп.

3. Рассчитаны эмпирические коэффициенты уравнений, связывающих константы удерживания стильбеноидов на кремнеземе, полученные методами ТСХ и НФ ВЭЖХ; установлена корреляция между хроматографическими параметрами удерживания стильбеноидов в условиях НФ и ОФ ВЭЖХ, что значительно облегчает оптимизацию условий анализа и препаративного разделения смесей стильбеноидов, выделение чистых целевых соединений.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»