WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

ld R d = - ln(1- ) (4), 2 Rmax где Rmax = m(na - ns ). Иными словами, Rmax соответствует сигналу ППР для гипотетического случая бесконечно толстого белкового слоя (d>>ld).

В нашем случае, когда сигнал R много меньше Rmax, формула (3) переходит в ld R d = (5) 2 Rmax R n По данным, приведенным на рис. 7, = =0,048. Здесь Rmax Rmax nmax определялся по известному из литературы значению показателя преломления белка ( np ) с массой 28 кДа (Voros, J., 2004), равному 1,48: nmax = np - ns, где ns = 1,33 (показатель преломления водного раствора). Оценка толщины слоя белка по формуле (5) дала значение d = 6,3 ± 0,6 нм. По данным рентгеноструктурного анализа матриксный белок можно аппроксимировать параллелепипедом с размерами 346 нм. Полученные результаты позволяют конкретизировать ориентацию белка относительно липидной поверхности, а именно, полагать, что «стержень» М1 расположен перпендикулярно мембране.

Наши данные хорошо согласуются с данными, полученными в (Schulze, I.T., 1972), где при помощи криоэлектронной микроскопии было показано, что толщина М1-каркаса в вирионе составляет 6 нм.

буфер Время, мин Рис. 8. Адсорбция белка М1 на отрицательно заряженной липидной поверхности (70% ДФФХ и 30% ДФФС). Буферный раствор: 10 мМ KCl, 2 мМ HEPES, рН 7. По оси ординат отложен сигнал ППР в относительных единицах. Первая стрелка показывает начало перфузии ячейки раствором, содержащим М1 в концентрации 500 нМ. Стрелки со знаком “||” указывают на момент остановки перфузии ячейки белковым раствором, со знаком “ ” – на момент возобновления перфузии. Последняя стрелка указывает на момент начала перфузии ячейки буферным раствором, не содержащим белка (в течение 1 часа).

Для того, чтобы подтвердить полученный методом КВП результат о необратимости адсорбции белка М1 на липидном бислое, после выхода адсорбционной кривой на стационарное значение производилась перфузия ячейки буферным раствором, не содержащим белка (рис. 8). Видно, что сигнал при этом практически не изменялся, а следовательно, десорбции белка не происходило.

Изучение адсорбции белка М1 на липидном бислое на подложке методом АСМ. Белок М1 в исходной объемной концентрации 2 мкМ адсорбировался на поверхность с бислойным липидным покрытием. Топограмма такой поверхности с адсорбировавшимся белком при значении рН водной среды приведена на рис. 9, слева. Состав буферного раствора 100 мМ NaCl, 2 мМ CaCl2, 2 мМ HEPES. Видно, что белок образует сплошную сеть на липидном бислое. Темные круглые участки – дефекты в липидном покрытии. Эти данные, как и представленные выше, показывают, что матриксный белок образует самоорганизующиеся структуры на плоском липидном бислое. Результат понижения значения рН среды до 5 приведен на рис. 9, справа: целостность слоя адсорбировавшегося белка в этом случае была нарушена.

Силовые кривые, снятые для каждого из случаев (данные не приведены), показывают, что упругие свойства системы адсорбировавшийся белоклипидный бислой заметно изменяются при изменении рН. А именно, в случае целой белковой сети (рН 7) система состоит из двух сред с различными упругими свойствами: липидного бислоя и слоя адсорбированного белка. Когда белковая сеть разрушена (рН 5), система ведет себя как однородная, а именно, ее упругие свойства определяются только липидным бислоем.

В измерениях методом сканирующей зондовой микроскопии информативной величиной является перепад высот, а не их абсолютное значение, т.к. за базовый уровень на топограмме принимается самая низкая точка на площадке сканирования, которой может оказаться дефект в липидном покрытии или иная неровность, например, дефект слюды. Поэтому толщину слоя белка М1 на липидной поверхности с большей точностью удалось определить при адсорбции белка в кислой среде, т.к. в этом случае лучше видна поверхность липидного бислоя. Определенная таким образом толщина белкового слоя составила 6±1 нм, что согласуется с полученным ранее методом ППР результатом.

5.70 nm 7.33 nm 200nm 200nm -5.68 nm -5.19 nm Рис. 9. Топограмма липидного бислоя состава 10% ДОФС и 90% ДОФХ с адсорбировавшимся белком М1 в буферном растворе со значением рН 7 (2 мМ HEPES, рисунок слева) и после замены буферного раствора на буферный раствор со значением рН (2 мМ MES, рисунок справа). Состав водной среды: 100 мМ NaCl, 2 мМ CaCl2. Справа от каждой топограммы приведены шкалы высот. Приведенный масштабный отрезок соответствует 200 нм. Исходная концентрация белка в растворе 2 мкМ.

ВЫВОДЫ 1. Показано, что белок М1 способен адсорбироваться на липидных поверхностях. Это свидетельствует о том, что наличие трансмембранных гликопротеинов для сборки белкового каркаса не является необходимым.

2. Полученные результаты свидетельствуют, что белок М1 при адсорбции на липидной поверхности может образовывать сеть, структура которой зависит от рН раствора и объемной концентрации белка.

3. Электрохимическим методом компенсации внутримембранного поля было показано, что при адсорбции белка М1 на липидную поверхность привносится положительный заряд, значение которого возрастает при понижении значения рН среды.

4. Результаты экспериментов по атомной силовой микроскопии свидетельствуют, что понижение значения рН приводит к разрушению белковой сети на липидной поверхности. Предложен возможный механизм дестабилизации сети – электростатическое отталкивание мономеров вследствие возрастания их заряда (см. п.3).

5. Перфузия ячейки с адсорбировавшимся на поверхности белком Мбуферным раствором в экспериментах по спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса не приводила к его десорбции. Таким образом, было показано, что адсорбция матриксного белка на липидной поверхности необратима.

6. Показано, что регистрируемые в экспериментах сигналы, связанные с адсорбцией М1, значительно возрастают в случае, если поверхность отрицательно заряжена. Тем не менее, на нейтральной поверхности адсорбция тоже происходит. Это свидетельствует о том, что в процессе адсорбции существенны как кулоновское взаимодействие разноименно заряженных липидов и белка, так и взаимодействие белка с нейтральными липидами, возможно, гидрофобное.

7. Двумя независимыми методами – спектроскопией поверхностного плазмонного резонанса и атомной силовой микроскопией – была определена толщина слоя адсорбировавшегося белка, которая составила около 6 нм. Это позволило предложить ориентацию адсорбированных молекул белка, в которой стержневидная молекула белка расположена перпендикулярно липидной поверхности.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1. Князев Д.Г., Радюхин В.А., Соколов В.С. Изучение межмолекулярных взаимодействий белков М1 вируса гриппа на поверхности модельной липидной мембраны методом компенсации внутримембранного поля // Биологические мембраны.- 2008.- Т.25.- №6.- С.491-500.

2. Knyazev D.G., Maksaev G.I. Research on virus matrix protein M1-bilayer lipid membrane interaction // Abstracts of VIII International Frumkin Symposium “Kinetics of electrode processes”.- Moscow, 2005.- P.205.

3. Князев Д.Г., Батищев О.В., Соколов В.С. Изучение взаимодействия матриксного белка вируса гриппа М1 с липидным слоем // Сб. Тезисы докладов XX зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии».- Москва, 2008.- С.57.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»