WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Из сравнения этой кривой с кривой для соответствующей концентрации М1 при pH 5.0 (рис. 1а) можно заключить, что время выхода кинетических кривых на насыщение при обоих pH приблизительно одинаково (около минут). Однако при рН 7.0 потенциал изменялся во времени немонотонно. В начале записи потенциал становился отрицательным, и только с течением времени он рос, достигая положительных значений. Мы полагаем, что немонотонное изменение потенциала при рН 7 вызвано изменением ориентации молекул белка на поверхности липидной мембраны в процессе формирования сети. Зависимость величины потенциала адсорбции от рН иллюстрирует рис. 2, где приведены значения этого потенциала при трех различных рН: 5.0, 6.0 и 7.0. Видно, что самое сильное влияние pH на потенциал имеет место в диапазоне от 7 до 6. В отдельных экспериментах было показано, что поверхностный заряд БЛМ данного состава при изменении рН от 7.0 до 5.0 практически не меняется. Таким образом, возможной причиной pHзависимости потенциала адсорбции М1 является изменение свойств самого белка, а не липидного бислоя. В принципе, увеличение потенциала при понижении рН может быть вызвано либо а) увеличением количества молекул белка, адсорбированных на мембране, либо б) изменением заряда или ориентации молекул белка на поверхности мембраны.

Рис. 3. Эксперимент с изменением Рис. 2. Вверху: Потенциал адсорбции при рН среды до рН 5.0 (стрелка 2 – введении белка (100 нМ), измеренный при добавление HCl) при достижении разных pH. Состав буферного раствора: 10 мМ стационарного значения после введения KCl, 0.1 мМ EDTA, 2 мМ MES (при рН 5 и 6), белка (100 нМ) при нейтральном pH мМ HEPES (при рН 7).

(стрелка 1). Состав буферного раствора: 10 мМ KCl, 0.1 мМ EDTA, мМ цитрат.

Был проведен эксперимент, который позволил проверить, какое из двух приведенных выше предположений верно. В нем адсорбция белка М1 сначала проводилась при рН 7, затем, после выхода потенциала адсорбции на стационарное значение, рН среды добавлением кислоты понижался до 5. Сразу же после этого наблюдался быстрый рост граничного потенциала: за 10 минут сигнал вырос на 20 мВ (рис. 3). Рост потенциала происходил значительно быстрее кинетики выхода потенциала на насыщение после добавки М1 в раствор. Этот факт нельзя объяснить вновь начавшейся после уменьшения рН среды адсорбцией белка: за столь малое время могли произойти лишь переориентация белка или изменение его заряда.

Зависимость потенциала адсорбции от ионной силы. Чтобы выяснить, не влияет ли рН на заряд белка, мы оценили величину привнесенного белком заряда на БЛМ, изучая зависимость потенциала адсорбции от ионной силы.

Результаты опытов, представленные на рис. 4, были получены по следующей схеме. Сначала на БЛМ адсорбировался белок М1. Адсорбция М1 проводилась при низкой ионной силе (10 мМ KCl) в среде с pH 6.0 или 7.0. Спустя примерно 3 часа с момента добавки М1 пошагово изменялась ионная сила сначала в цисотсеке, а затем в транс-отсеке, не содержащем белка. Запись такого эксперимента при pH 6.0 представлена на рис. 4а. Изменение ионной силы в отсеках начиналось с момента, когда кривая адсорбции М1 выходила на насыщение. Изменение потенциала происходило быстро по сравнению с длительностью адсорбции белка. Так как измерялась разность граничных потенциалов БЛМ, то увеличение ионной силы в разных отсеках давало эффект разного знака. Изменение потенциала при введении KCl в разные отсеки различалось и по абсолютной величине: в цис-отсеке, содержащем белок, изменение потенциала было меньшим по сравнению с транс-отсеком, где белок отсутствовал. Судя по полученным результатам, белок привносит на мембрану небольшой положительный заряд по сравнению с абсолютной величиной исходного отрицательного заряда БЛМ. При этом адсорбция белка не вызывает перезарядку ее поверхности.

Заряд, привнесенный белком на БЛМ, был оценен следующим образом.

Используя зависимость изменения граничного потенциала от ионной силы в каждом из двух отсеков, мы определяли величины поверхностного заряда для обеих сторон БЛМ: с адсорбировавшимся белком (цис-сторона) и без него (транс-сторона). Зависимости изменения граничного потенциала от ионной силы в соответствующем отсеке (рис. 4а) были перестроены следующим образом. Значение потенциала для каждой концентрации KCl в соответствующем отсеке было получено путем сложения эффектов от всех предыдущих добавок соли в этот отсек (рис. 4б) в предположении, что изменения граничных потенциалов от каждого из монослоев с обеих сторон БЛМ были независимыми друг от друга. Нулевые уровни для каждой зависимости соответствуют исходной разности граничных потенциалов в фоновом электролите (10 мМ KCl) перед повышением его ионной силы. Расчет поверхностного заряда производился в рамках модели Гуи-Чепмена по формуле, описывающей разность поверхностных потенциалов, соответствующих начальному (в растворе 10 мМ KCl) и конечному (после увеличения ионной силы) состояниям, как и в работе (Соколов, В.С. и др., 1980):

a2 + a2 +2RT = ln (1), F a1 + a1 + где ai =, – поверхностный заряд монослоя со стороны цис- или 8RTci транс-отсека, – абсолютная диэлектрическая проницаемость среды, R – газовая постоянная, T – абсолютная температура, F – постоянная Фарадея, ci – концентрация KCl. Индекс 1 относится к начальному состоянию, когда концентрация соли составляла 10 мМ, индекс 2 – к раствору после добавки KCl (с концентрацией 30 мМ, 60 мМ или 120 мМ). Теоретическая кривая для каждого из отсеков проводилась по экспериментальным точкам методом наименьших квадратов, где свободным параметром был поверхностный заряд.

Аналогичным образом определялись значения поверхностных зарядов при pH 7.0 (данные не приведены). Рассчитанные по уравнению (1) значения поверхностных зарядов БЛМ со стороны транс-отсека при двух значениях рН оказались близкими: = 2 ± 0.1 мкКл / см2, = 2.3 ± 0.1 мкКл / см2. Они pH 6 pH хорошо согласуются с результатом измерения электрофоретической подвижности липосом из тех же липидов: = 2.1 ± 0.1 мкКл / см2. Значение pH привносимого белком на поверхность положительного заряда находится как разность между полученными значениями для каждого из монослоев при соответствующем pH. Этот заряд при pH 6.0 ( = 1.6 ± 0.1 мкКл / см2 ) оказался pH примерно в 3 раза выше, чем при pH 7.0 ( = 0.5 ± 0.1 мкКл / см2 ).

pH Рис. 4. а) Последовательное увеличение ионной силы водного раствора в ячейке после достижения стационарного значения потенциала в присутствии белка (100 нМ), добавленного в начальный момент времени. Исходная концентрация KCl в ячейке 10 мМ.

Добавление 2 М раствора КСl производилось с цис-стороны БЛМ (широкие стрелки вверх) и транс-стороны БЛМ (тонкие стрелки вниз) до концентрации 30, 60 и 120 мМ для стрелок 1-3, соответственно. Исходный буферный раствор 10 мМ KCl, 0.1 мМ EDTA, 2 мМ MES, рН 6.0. б). Приращение граничного потенциала в эксперименте, приведенном на рис. 6а в зависимости от концентрации KCl в цис-отсеке ячейки (темные точки) и в транс-отсеке (светлые точки). Теоретические кривые построены по уравнению (1) при значении плотности поверхностного заряда, равном = 0.4 ± 0.03 мкКл / см2 и = 2 ± 0.1 мкКл / см2 для цис- и трас-стороны БЛМ, соответственно.

На основании известного аминокислотного состава белка можно показать, что полученное выше изменение величины привнесенного заряда в зависимости от рН коррелирует с изменением суммарного заряда всей молекулы М1. Оценка заряда проводилась в предположении, что значения pKa боковых групп аминокислот в полипептидной цепи не отличаются от соответствующих pKa одиночных аминокислот в растворе (Saggerson, D., 1988). В рассматриваемом диапазоне рН основной вклад в изменение заряда белковой молекулы будут вносить такие аминокислоты, как гистидин, аспарагин, глутамин. Расчет показал, что заряд матриксного белка при pH 7.составляет +8, а при pH 5.0 и 6.0 – +16,2 и +11.3 ед. элементарного заряда соответственно. При этом основной вклад в положительный заряд белковой молекулы вносит С-домен. Обычно считают, что С-домен в вирусе обращен в водный раствор и взаимодействует с рибонуклеопротеиновыми (РНП) комплексами вириона. Однако, на плоской БЛМ, в отсутствие РНП, ориентация С-домена может отличаться от таковой на мембране вириона. Так, в нашей модельной системе при закислении среды не исключено такое изменение ориентации С-домена относительно мембраны, что отрицательный заряд липидов будет компенсироваться положительным зарядом и этого домена.

Различие в оценках, полученных выше по результатам измерения зависимости граничного потенциала от ионной силы раствора (рис. 4) и по аминокислотному составу, не столь велико. Оно может быть объяснено тем, что размеры белка сопоставимы с толщиной диффузной части двойного электрического слоя, и на потенциал адсорбции наибольшее влияние оказывают не все заряженные участки М1, а только находящиеся в непосредственной близости от поверхности мембраны. Возможно, такими участками в домене, ответственном за взаимодействие с БЛМ (N-домене), являются положительно заряженные -спирали остатков 108-117 и 89-104, поскольку они несут на себе большой положительный заряд.

Чтобы изучить влияние ионной силы на потенциал адсорбции белка в более широком диапазоне, мы изменили предыдущий эксперимент и варьировали концентрацию KCl до введения белка. В экспериментах, результаты которых представлены на рис. 5, М1 адсорбировался на БЛМ, сформированной из ДФФС, в водной среде с концентрацией KCl 10 мМ, мМ, 500 мМ и 1000 мМ при pH 7.0. Потенциал адсорбции был положительным и составил 22 и 14 мВ при концентрации KCl 10 и 100 мМ, соответственно. При дальнейшем увеличении концентрации потенциал практически не менялся. Это может свидетельствовать о том, что при адсорбции белка меняется не только поверхностная, но и дипольная компонента граничного потенциала.

Рис. 5. Значения потенциала адсорбции белка (100 нМ) на отрицательно заряженной БЛМ, сформированной из ДФФС, измеренные при разной ионной силе раствора. Состав исходного буферного раствора: 2 мМ HEPES, рН 7 и указанная на оси абсцисс концентрация KCl.

Зависимость потенциала адсорбции от состава БЛМ. Потенциалы адсорбции белка на мембранах, сформированных из смеси ДФФХ и ДФФС в мольном отношении 7:3, либо только из ДФФХ, представлены на рис. 6. Видно, что в присутствии отрицательно заряженного липида потенциал адсорбции существенно выше как при рН 5.0, так и при рН 7.0. Значения потенциалов адсорбции при рН 5.0 на отрицательно заряженной и нейтральной мембране составили 31 мВ и 14 мВ, соответственно. В экспериментах по адсорбции Мна БЛМ разного состава была отмечена следующая особенность: форма кинетической кривой, а именно, наличие или отсутствие немонотонной кинетики изменения потенциала, определяется не только pH водного раствора, но и наличием в БЛМ отрицательно заряженного липида. При концентрации М1 100 нМ падение потенциала на начальном этапе адсорбции (аналогичное представленному на рис. 1б) на нейтральных БЛМ (ДФФХ) наблюдалось как при низком, так и при нейтральном значениях pH, и, напротив, это падение отсутствовало при обоих pH в случае отрицательно заряженной БЛМ (ДФФС).

Ряд контрольных экспериментов, которые были проведены на БЛМ из диолеоилфосфатидилсерина и диолеоилфосфатидилхолина показали, что потенциал оставался прежним, когда фитановые углеводородные цепи липидов заменялись на олеиновые. Это означает, что на адсорбцию белка влияют не углеводородные цепи липидов, а их полярные группы.

Рис 6. Потенциал адсорбции белка (100 нМ) на нейтральной БЛМ из ДФФХ (А), и отрицательно заряженной БЛМ из 70% ДФФХ и 30% ДФФС (Б). Состав исходного буферного раствора: 100 мМ KCl и 2 мМ HEPES, рН 7 (темные колонки), либо 2 мМ MES, рН 5 (заштрихованные колонки).

В литературе обсуждался вопрос, способен ли белок М1 встраиваться в липидный бислой (Sha, B.D. and Luo, M., 1997). Пытаясь ответить на него, мы измеряли проводимость БЛМ при адсорбции на ней белка М1. Если бы белок встраивался в мембрану, это должно было приводить к увеличению ее электропроводности. Однако, во всем диапазоне концентраций белка М1 в растворе увеличения проводимости БЛМ не наблюдалось. Таким образом, наши результаты свидетельствуют о том, что белок М1 не встраивается в липидную мембрану. Такой же вывод был сделан на основе данных, полученных методом электронной микроскопии, согласно которым белок расположен вне липидного бислоя (Wrigley, N.G., 1979).

Изучение адсорбции белка М1 на липидном монослое на подложке методом ППР. Этот метод позволяет получить толщину слоя адсорбировавшегося белка в случае, когда этот слой можно аппроксимировать сплошной пленкой.

Приведенная ниже оценка проводилась по результатам серии экспериментов по адсорбции белка М1 на ОДКТ (рис. 7). Приведенные графики представляют собой изменение эффективного показателя преломления среды над пластиной в относительных единицах, в зависимости от концентрации белка в растворе при двух значениях ионной силы. Видно, что кривые выходят на насыщение.

Толщина адсорбировавшегося слоя М1 была рассчитана в предположении, что данное насыщение соответствует полному заполнению поверхности белком.

Это предположение подтверждается результатами АСМ-экспериментов, которые будут приведены ниже. Сигнал ППР с хорошей точностью можно считать пропорциональным показателю преломления среды над пластиной (Jung, L.S. et al., 1998):

R = m(neff - ns ) (2), где R – сигнал ППР (ответ на изменение показателя преломления приповерхностной области), neff – эффективный показатель преломления среды над пластиной, ns –показатель преломления раствора над адсорбировавшейся пленкой, m – коэффициент пропорциональности. Величина R берется на уровне выхода кинетической кривой на насыщение.

Поскольку заполнение поверхности полное, мы можем записать neff как:

2z 2z 2 z 2d - d - - - 2 ld ld ld ld neff = a s n(z)e dz = ld n e dz + n e dz =1- e (na - ns)+ ns (3), ld d 0 где d – толщина адсорбировавшегося слоя, ld – характерная длина затухания электромагнитного поля, которая по грубой оценке составляет 37 ± 13% от длины волны падающего света (в нашем случае ld 240 нм), z – координата по оси, перпендикулярной плоскости пластины и направленной от металла в раствор, n(z) – показатель преломления как функция z.

Нормировочный множитель находится из условия n(0)=na.

ld концентрация МРис. 7. Концентрационная зависимость адсорбции М1 на поверхности, сформированной из отрицательно заряженного тиола (КГДТ). Кружки соответствуют экспериментам с 10 мМ KCl, звездочки – 100 мМ KCl. Буферный раствор: 2 мМ HEPES, рН 7. По оси ординат отложен сигнал ППР в относительных единицах.

Таким образом, комбинируя (2) и (3), а затем логарифмируя получившееся уравнение, получаем:

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»