WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

tuberculosis, 28,6% – M. bovis, 28,6% – M. bovis BCG (табл. 3).

Таблица 3.

Выявление микобактерий туберкулезного комплекса в диагностическом материале больных с установленным первичным иммунодефицитом, находящихся на лечении в отделении клинической иммунологии РДКБ (n=33) № Результаты Кол-во % п/п 1. M. tuberculosis 3 9,09% 2. M. bovis 2 6,06% 3. M. bovis BCG 2 6,06% 4 Отрицательные 26 78,79% Результаты, полученные при исследовании диагностического материала от детей с онкогематологическими заболеваниями (n=24) показали, что ДНК микобактерий туберкулезного комплекса была выявлена в 37,5% случаев, из которых в 100% были идентифицированы M. tuberculosis.

Таким образом, при использовании технологий, применяемых для выявления ДНК микобактерий туберкулезного комплекса, необходим дифференцированный подход с учетом возможности применения различных тест-систем. Для выявления микобактерий туберкулезного комплекса желательно использовать системы, основанные на клонировании различных последовательностей. Определение вида представителей M. tuberculosis complex у больных, как с иммунодефицитом, так и при различных патологических состояниях, является важным для врачей при назначении больным соответствующего лечения.

Определение вида микобактерий входящих в комплекс MAIS и дифференциация их от M. tuberculosis complex с помощью ПЦР-рестрикционного анализа Нетуберкулезные микобактерии широко распространенны в природе, их выделяют из естественных водоемов, систем водоснабжения, почвы. Одним из наиболее важных свойств НТМБ является их способность при определенных условиях вызывать заболевания человека – микобактериозы [Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005; Katoch V., 2004]. Поскольку микробиологические методы, особенно при посеве на плотные среды, длительны по времени и их результативность недостаточно высока даже при использовании жидких сред, внедрение молекулярно-биологических методов, сокращающих определение вида до 24-48 часов, и позволяющих в 90% случаев получить достоверные результаты важно для своевременного назначения больному адекватного лечения [Скотникова О.И., 2005; Heifets L., 2004; Katoch V., 2004].

Была предпринята попытка, адаптировать метод, предложенный Wong D. et al., (2001) для определения вида микобактерий, входящих в комплекс MAIS, и отличия их от комплекса M. tuberculosis. На начальном этапе исследования изучали рестрикционные профили комплекса MAIS и M. tuberculosis после обработки ампликонов, синтезированных с фрагмента гена hsp65, рестриктазой Cfr13I, которую предложили Wong D. et al., (2001). Результаты представлены на рисунке 4.

1 2 3 Рис. 4. Профили рестрикции комплекса MAIS после обработки ампликонов, синтезированных с фрагмента гена hsp65 рестриктазой Cfr13I 1 – M. scrofulaceum ATCC35787; 2 – M. intracellulare ATCC35761; 3 – M. avium ATCC35712; 4 – M. tuberculosis H37Rv ATCCДлины рестрикционных фрагментов после использования рестриктазы Cfr13I составляли для M. tuberculosis – 200 п.н., 40 п.н., для M. avium и M. intracellulare – п.н., 125 п.н., 100 п.н., 70 п.н. и для M. scrofulaceum – 200 п.н., 125 п.н., 100 п.н., п.н.

Результаты рестрикционного анализа, представленные на рисунке 4, позволили установить отличие профилей рестрикции комплекса MAIS (1,2,3) от M. tuberculosis (4). При этом наблюдалось полное совпадение рестрикционных профилей M. avium (3) и M. intracellulare (2). В связи с тем, что с помощью рестриктазы Cfr13I нельзя точно дифференцировать виды M. avium и M. intracellulare, мы попытались из большого спектра рестриктаз подобрать ту из них, с помощью которой можно было бы получить специфичные рестрикционные профили для этих видов микобактерий.

В результате дальнейшего подбора сочетания двух факторов: наличия определенных последовательностей в изучаемом фрагменте гена и активности исследуемой рестриктазы к этим последовательностям, выбрана рестриктаза Hin6I, оказавшаяся изошизомером CfoI и позволяющая получить четкое разделение видов M. avium и M. intracellulare. Результаты представлены на рисунке 5, где видны четкие различия рестрикционных профилей комплексов M. tuberculosis (7), MAIS (4,5,6), а также M. kansasii, M. fortuitum/ M. chelonae. Длина рестрикционных фрагментов после обработки рестриктазой Hin6I для M. tuberculosis complex составила 125 п.н., 85 п.н., 75 п.н., M. avium 185 п.н., 85 п.н., M. intracellulare 185 п.н., 100 п.н., M. scrofulaceum 185 п.н., 75 п.н., 40 п.н., M. fortuitum 125 п.н., 85 п.н., 50 п.н., M. chelonae 125 п.н., п.н., 50 п.н., M. kansasii 125 п.н., 75 п.н., 50 п.н.

1 2 3 4 5 6 7 М Рис. 5. Профили рестрикции различных видов рода Mycobacterium, полученные после обработки рестриктазой Hin6I 1 – M. kansasii ГИСК, 2 – M. fortuitum ГИСК, 3 – M. chelonae ГИСК, 4 – M.

scrofulaceum АТСС35787, 5 – M. intracellulare АТСС35761, 6 – M. avium АТСС35712, 7 – M.

tuberculosis H37Rv ATCC25618, М – маркер (шаг маркера представлен с правой стороны электрофореграммы и выражен в парах нуклеотидов) Таким образом, с помощью одной рестриктирующей эндонуклеазы Hin6I можно дифференцировать виды микобактерий, входящие в комплекс MAIS, и отличить их от M.tuberculosis complex, что значительно упрощает и удешевляет исследование по сравнению с тест-системами, описанными в литературе, где для таких же целей используются две и более рестриктазы [Patel R. et al. 1986; Telenti A.

et al., 1993; Devallois A. et al., 1997; Roth A. et al., 2000; Brunello F. et al., 2001]. Кроме того, использование одной рестриктазы Hin6I позволяет определить вид не только представителей комплекса MAIS, но и некоторых других видов микобактерий (M.

kansasii, M. fortuitum/M. chelonae, M. xenopi, M. gordonae, M. marinum и.т.д.), что расширяет возможности разработанной нами тест-системы «MAIS-диф» (рис. 6).

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M Рис. 6. Профили рестрикции различных видов рода Mycobacterium, полученные после обработки рестриктазой Hin6I 1 – M. xenopi; 2 – M. marinum; 3 – M. gordonae; 4 – M. szulgai; 5 – M. kansasii; 6 – M.

intracellulare; 7 – M. chelonae; 8 – M. fortuitum; 9 – M. intracellulare; 10 – M. avium; 11 – M.

tuberculosis complex; М – маркер Проведен анализ штаммов, выделенных от больных с подозрением на туберкулез. Сравнение профилей рестрикции ДНК исследуемых образцов с ДНК контрольных штаммов (заведомо известных видов) показало, что исследуемые культуры можно отнести к нетуберкулезным микобактериям, что было подтверждено данными микобактериологической идентификации.

Необходимо отметить, что для различных видов микобактерий характерно постоянство рестрикционной картины, так как в процессе рестрикции происходит образование фрагментов ДНК определенной длины. Штаммы микобактерий одних и тех же видов, полученные из различных музеев, имели одни и те же профили рестрикции, что говорит о высокой специфичности тест-системы.

Все указанные культуры микобактерий, выделенные повторно из материала от одних и тех же больных, относились к одному и тому же виду. Это подтверждает их этиологическую роль.

Результаты определения ПЦР-рестрикционным анализом и бактериологическими методами вида микобактерий, выделенных из диагностического материала больных с подозрением на туберкулез.

Для изучения возможности использования метода ПДРФ гена hsp65 в целях диагностики были исследованы музейные штаммы НТМБ и M. tuberculosis complex, 66 культур микобактерий, выделенных в ЦБЛ МНПЦБТ из диагностического материала 45 больных с подозрением на туберкулез, а так же 18 образцов ДНК, выделенной из бронхоальвеолярного лаважа 18 ВИЧ-инфицированных больных с подозрением на туберкулез находившихся на лечении в Московском городском центре борьбы со СПИДом Департамента здравоохранения города Москвы.

Частота выявления НТМБ, выделенных от больных, с помощью метода ПДРФ гена hsp65, в зависимости от видовой принадлежности представлена в таблице 4.

Таблица 4.

Видовая принадлежность НТМБ методом ПДРФ гена hsp65 и их распределение по видам № п/п Название вида микобактерий Количество % 1. M. avium 20 35,71% 2. M. fortuitum/M. chelonae 10 17,86% 3. M. kansasii 9 16,07% 4. M. xenopi 7 12,5% 5. M. tuberculosis complex 4 7,14% 6. M. intracellulare 3 5,36% 7. M. gordonae 2 3,57% 8. M. marinum 1 1,79% Итого: 56 100% Из таблицы 4 видно, что в наибольшем количестве случаев в исследуемых образцах представлены M. avium (35,71%), меньше M. fortuitum (17,86%), еще меньше M. kansasii (16,07%) и т.д.

Значительный интерес представляло сопоставление результатов идентификации НТМБ, полученных разными методами (табл. 5).

Сравнение результатов определения видов микобактерий двумя методами показало высокий процент (88,6%) конкордантности полученных результатов.

Несовпадения в большинстве случаев можно объяснить наличием в диагностическом материале двух видов микобактерий, то-есть смешанных культур. После рассева культур, выделенных из диагностического материала 5 больных на плотной среде Левенштейна-Йенсена, на чашки Петри со средой Middlebrook 7H11 получен рост колоний с различными культуральными свойствами, что подтвердило предположение о возможном выделении из диагностического материала этих пациентов так называемых смешанных культур, идентификация которых связана с определенными сложностями. При применении метода ПДРФ гена hsp65 и микробиологической идентификации получено полное совпадение результатов. Чувствительность метода ПДРФ гена hsp65 составила 100%, a специфичность 88,6%.

Таблица 5.

Сравнение распределения по видам культур микобактерий (n= 53) методами ПДРФ гена hsp65 и микробиологической идентификации № Микробиологическая Вид микобактерий ПДРФ гена hspп/п идентификация 1. M.avium 2. M. intracellulare 3. M. fortuitum 4. M. chelonae 5. M. kansasii 7 6. M. xenopi 7 7. M. tuberculosis complex 4 8. M. gordonae 2 9. M. marinum 1 10. M. flavescens - В случаях смешанных культур профиль рестрикции анализируемой культуры изменяется (рис.7).

1 2 М Рис. 7. Полученные после обработки рестриктазой Hin6I профили рестрикции культур кислотоустойчивых микобактерий, выделенных из диагностического материала больных с подозрением на туберкулез 1 – 28857(2); 2 – 28857(1); М – маркер На рисунке 7 представлен случай наложения профилей рестрикции различных видов микобактерий M. intracellulare и M. fortuitum/M. chelonae (2), полученный при изучении смешанной культуры 28857. Интерпретация результатов не составила труда, и рестрикционный профиль трактовали как идентичный M. intracellulare, но при ПДРФ анализе колоний, выделенных при рассева на чашках со средой Middlebrook 7H11, один вид колоний четко идентифицировался как M. fortuitum/M.

chelonae (1), а другой характеризовался наложением профилей рестрикции характерных для M. intracellulare и M. fortuitum/M. chelonae (2). Таким образом с помощью тест-системы «MAIS-диф» можно идентифицировать несколько видов микобактерий в исследуемом материале.

У 8 больных отмечено повторное (в 6 случаях двукратное и в 2 троекратное) выделение культур НТМБ из диагностического материала. Причем из диагностического материала 7 больных были выделены одноименные виды микобактерий, а в одном случае разноименные (№№ 31079 – M. avium, 1498 – M.

fortuitum/ M. chelonae). Результаты определения вида микобактерий в случаях повторного выделения культур НТМБ полностью совпадали с данными микробиологической идентификации.

После проведения идентификации культур НТМБ с помощью тест-системы «MAIS-диф» была предпринята попытка адаптировать эту систему для определения вида микобактерий, используя ДНК, выделенную непосредственно из диагностического материала. Поскольку наибольшему риску развития микобактериозов подвержены лица, страдающие иммунодефицитами, в первую очередь, ВИЧ-инфекцией и СПИДом, было решено использовать для анализа ДНК, полученную из биологического материала таких больных. ДНК была выделена в соответствии с методическими рекомендациями, разработанным в МНПЦБТ [Скотникова О.И. и др., 2001], из 18 образцов бронхоальвеолярного лаважа ВИЧинфицированных больных, любезно предоставленных Московским городским центром борьбы со СПИДом Департамента здравоохранения города Москвы. После проведения ПДРФ гена hsp65 было получено 17 отрицательных и 1 положительный результат, профиль рестрикции которого соответствовал M. tuberculosis complex. По всей видимости, для определения вида микобактерий непосредственно в диагностическом материале ВИЧ-инфицированных больных не хватало ДНК для ее рестрикционного анализа, что диктует необходимость либо увеличивать объем исследуемого образца, либо проводить культуральное исследование диагностического материала для выделения чистой культуры микобактерий.

Таким образом, необходимость своевременной диагностики микобактериальной инфекции, вызванной представителями M. tuberculosis complex (M. bovis, M. bovis BCG) и НТМБ, ставит перед лабораторией задачу быстрой и точной видовой идентификации микобактерий. Бесспорно, наиболее отвечающими этой задаче являются молекулярно-генетические методы, позволяющие за короткий срок дать ответ о видовой принадлежности представителей рода Mycobacterium.

Выводы 1. Определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК с помощью рестриктаз (RsaI и TaaI) после проведения ПЦР-диагностики МБТ комплекса повышает специфичность видовой идентификации M.tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG с получением результатов в течение 24-48 часов.

2. Частота обнаружения ДНК МБТ комплекса у больных туберкулезом или с подозрением на туберкулез (n=133) ДНК микобактерий туберкулезного комплекса достигает 82,7% случаев, из них 94,5% приходится на долю M. tuberculosis, 3,6% – M.

bovis, 1,8% – M. bovis BCG.

3. У детей с первичным иммунодефицитом (n=33) частота обнаружения ДНК комплекса МБТ не превышает 21,1% случаев, при этом доля M.tuberculosis в 1,5 раза выше (42,8%) по сравнению с M. bovis (28,6%) и M. bovis BCG (28,6%).

4. У детей с онкогематологическими заболеваниями (n=24) частота обнаружения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса составляет 37,5% случаев, причем исключительно за счет M.tuberculosis (100%).

5. Впервые полученная тест-система «MAIS-диф», разработанная на основе клонирования определенных участков гена hsp65 с последующей обработкой их рестриктазой Hin6I, позволяет за 24-48ч идентифицировать микобактерии комплекса MAIS, некоторые другие виды НТМБ (M. fortuitum, M. kansasii, M. xenopi, M.

gordonae, M. marinum), и дифференцировать их от M. tuberculosis complex, что упрощает и удешевляет анализ по сравнению с тест-системами, использующими две и более рестриктазы.

6. Результаты видовой идентификации микобактерий комплекса MAIS микробиологическим методом и ПДРФ совпадают в 88,6% случаев, за исключением смешанных культур микобактерий.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»