WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Краснова Мария Александровна ВИДОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКОБАКТЕРИЙ МЕТОДАМИ ПЦР-РЕСТРИКЦИОННОГО АНАЛИЗА 03.00.07 – Микробиология

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2007

Работа выполнена в Московском городском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Мороз Аркадий Максович Доктор биологических наук Скотникова Ольга Ивановна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Зубков Михаил Николаевич Доктор биологических наук, Черноусова Лариса Николаевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Росздрава

Защита состоится «» «» 2007г. в часов на заседании диссертационного совета Д208.046.01 при Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.

Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (125 212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Автореферат разослан «» «_» 2007г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук С.Ю. Комбарова 1

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Род Mycobacterium состоит из нескольких групп кислотоустойчивых микобактерий, среди которых встречаются патогенные для человека и животных.

Кроме безусловных патогенов человека, таких как M. leprae и Mycobacterium tuberculosis complex, куда входят M. tuberculosis (МБТ), M. bovis, M. bovis BCG, M.

microti, M. africanum, существует целый ряд условно-патогенных нетуберкулезных микобактерий (НТМБ), в частности относящихся к комплексу MAIS (M. avium, M.

intracellulare, M. scrofulaceum), которые могут вызвать микобактериозы, определяемые как «болезнь компрометированного хозяина».

У детей после вакцинации БЦЖ может развиться локальная или генерализованная БЦЖ-инфекция. В результате заражения M. bovis, не только у животных, но и у людей, развивается процесс, который приблизительно в 6% случаев заканчивается летальным исходом [Vordermeier H. et al., 2000; Bahri I. et al., 2001].

Во всём мире отмечается рост заболеваемости микобактериозами. В Японии в 1998 г. заболеваемость составляла 2,3/100000 населения в год, а в странах Северной Америки и Европы колеблется от 1 до 15 на 100000 жителей [Masakazu A., 1998;

Marras T., Daley C., 2002]. Наиболее часто встречавшиеся в 1981 – 2001гг. как в Японии, так и в Северо-Западном регионе Российской Федерации микобактериозы были вызваны M. avium и M. intracellulare [Оттен Т.Ф. и др., 2004; Masakazu A., 1998;

Sakatani M., 2005].

Известно, что основной группой риска в отношении микобактериозов являются ВИЧ-инфицированные лица [Marras T., Daley C., 2002]. Проведённые исследования показали, что диссеминированная микобактериальная инфекция, вызванная M. aviumintracellulare complex (MAC), развивается у 25% – 50% ВИЧ-положительных больных, причем риск диссеминации инфекционного процесса зависит от тяжести иммунодефицита [Afessa B., 2001; Richter E. et al., 2002; Adle-Biassette H. et al., 2003;

Bonard D. et al., 2004].

Особенностью заболеваний, вызываемых разными видами микобактерий, особенно на ранних стадиях, является сходная клиническая картина, что может привести к назначению больному неадекватной химиотерапии. Поэтому в настоящее время все большее внимание исследователи уделяют проблеме диагностики микобактериальной инфекции, вызванной M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, а также нетуберкулезными микобактериями, в частности относящимися к комплексу MAIS.

В микобактериологических лабораториях видовая идентификация микобактерий основывается на культуральных свойствах, таких как пигментообразование, способность роста культуры при различных температурах и скорость роста, а также на биохимических свойствах, которые зависят от ферментативной активности разных видов микобактерий [Ильина Т.Б., 1975; Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005; Rist N. et al., 1967]. По данным Т.Ф. Оттен и соавт. (2004), в среднем сроки идентификации нетуберкулёзных микобактерий этими методами составляют более 6 месяцев.

Внедрение в практику молекулярно-генетических методов открывает новые возможности для быстрого и точного определения вида микобактерий. Однако, сложность создания тест-систем для определения вида возбудителя объясняется очень незначительными различиями геномов микобактерий. Как правило, применяют сочетание методов: на первом этапе используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР), на втором этапом – метод гибридизации с соответствующими олигонуклеотидами или рестрикционный анализ. Методом, контролирующим изучаемые последовательности, является секвенирование, которое применяется в референс-лабораториях.

Более приемлемым для лабораторной диагностики является анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), позволяющий получить легко различимые рестрикционные профили для комплексов Mycobacterium tuberculosis, МАIS (M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum) и других микобактерий [Wong D. et al., 2001].

Для дифференциального определения вида микобактерий комплекса M.

tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG) используют ПЦР-системы, основанные на анализе делеции гена RD1 и повторяющихся элементов межгенной области оперона SenX3-RegX3 [Magdalena J. et al., 1998; Cunningham J. et al., 2000].

И.Н. Корневой, В.В. Дёмкиным (2002) разработана ПЦР-система «ТУБ-ДИФ», идентифицирующая данные микобактерии. Видовая идентификация основана на различиях в длине специфического амплифицированного фрагмента. Вместе с тем в случае присутствия нескольких видов микобактерий в анализируемом образце требуется проведение дополнительного рестрикционного анализа полученных ампликонов.

В литературе описаны тест-системы, основанные на анализе вариабельных видоспецифичных нуклеотидных последовательностей гена hsp65, позволяющие идентифицировать комплексы Mycobacterium tuberculosis, MAIS (M. avium, M.

intracellulare, M. scrofulaceum), но эти методики требуют применения нескольких рестриктаз, что увеличивает время анализа [Wong D. et al., 2001].

Таким образом, существенным недостатком молекулярно-биологических тестсистем для видовой идентификации микобактерий является диссонанс между сроками идентификации и технической сложностью существующих методов, что резко сокращает возможность их применения для нужд клиники. На основании вышесказанного задача разработки новых и совершенствование уже имеющихся быстрых и специфических методов видовой идентификации микобактерий остается по-прежнему актуальной.

Цель исследования Разработать комплекс молекулярно-генетических методов для видовой идентификации M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG и микобактерий комплекса MAIS (M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum).

Задачи исследования 1. Осуществить клинико-диагностическую апробацию тест-системы «ТУБДИФ», для идентификации микобактерий M. bovis, M. bovis BCG и M. tuberculosis.

2. Разработать собственную тест-систему рестрикционного анализа для уточнения данных, полученных после применения «ТУБ-ДИФ».

3. Изучить возможность выявления микобактерий комплекса M. tuberculosis у больных различными заболеваниями, находящихся на лечении в Московском научнопрактическом центре борьбы с туберкулёзом Департамента здравоохранения города Москвы (МНПЦБТ) и Российской детской клинической больнице МЗ РФ (РДКБ).

4. Разработать тест-систему «MAIS-диф», которая может быть применена для одновременной идентификации M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M.

scrofulaceum.

5. Испытать тест-систему «MAIS-диф» на диагностическом материале и культурах кислотоустойчивых микобактерий, выделенных от больных, находящихся на лечении в МНПЦБТ и Московском городском центре борьбы со СПИДом Департамента здравоохранения города Москвы.

Научная новизна Усовершенствованы различные методические подходы обработки клинических образцов и выявления кислотоустойчивых микобактерий методом ПЦР. Подобраны рестриктазы и условия рестрикции для определения комплексов M. tuberculosis, MAIS, некоторых других видов НТМБ и осуществлён ПЦР-рестрикционный анализ для их характеристики.

В результате проведенных исследований впервые разработаны:

- тест-система рестрикционного анализа для уточнения вида микобактерий M.

bovis, M. bovis BCG и M. tuberculosis после проведения исследований с помощью тестсистемы «ТУБ-ДИФ»;

- тест-система идентификации видов микобактерий комплекса MAIS (M.

avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum), а также некоторых других НТМБ и M.

tuberculosis на основе ПЦР-рестрикционного анализа (приоритетная справка №2004137089 от 2005 года).

Определены возможности и рамки применения вышеназванных тест-систем, позволяющих на основе ПЦР-анализа идентифицировать M. tuberculosis, M. bovis, M.

bovis BCG и микобактерии комплекса MAIS (Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium scrofulaceum).

Практическая значимость работы Методы идентификации микобактерий, основанные на ПЦР, дают возможность быстро (в течение 24-48 часов) и точно определить вид возбудителя, что позволяет рекомендовать их как наиболее перспективные методы диагностики микобактериозов. Возможность точной идентификации микобактерий в различном диагностическом материале позволяет своевременно назначить больным соответствующую химиотерапию, повысить её эффективность, сократить сроки и стоимость лечения.

Положения, выносимые на защиту 1. Результаты клинико-диагностической апробации отечественной тестсистемы «ТУБ-ДИФ» свидетельствуют о её эффективности для обнаружения МБТ.

Применение рестрикционного анализа повышает достоверность дифференциации M.

bovis и M. bovis BCG, основанной на методе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (рестриктазы RsaI и TaaI), клонируемых фрагментов межгенных последовательностей оперона SenX3-RegX3.

2. Применение рестрикционного анализа повышает достоверность дифференциации M. bovis и M. bovis BCG, основанной на методе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (рестриктазы RsaI и TaaI), клонируемых фрагментов межгенных последовательностей оперона SenX3-RegX3.

3. Разработанная тест-система «MAIS-диф» позволяет проводить видовую идентификацию нетуберкулезных микобактерий комплекса MAIS, некоторых других видов НТМБ и дифференциацию их от M. tuberculosis complex.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на V Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней», Москва 2004; Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2005; Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы фтизиатрии, пульмонологии и торакальной хирургии», Москва, 2006.

Публикации По теме диссертации опубликовано 7 статей, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК России и методические рекомендации «Определение вида микобактерий комплексов MAIS и Mycobacterium tuberculosis методом рестрикционного анализа».

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения и выводов. В тексте содержится 12 рисунков и 18 таблиц. Библиография включает 143 источника литературы, из них 18 на русском и 125 на иностранных языках.

Содержание работы Материал и методы исследования Пациенты и диагностический материал В работе были использованы пробы ДНК, выделенные из 254 образцов различного биологического материала (мокрота – 146, бронхоальвеолярный лаваж – 3, кровь – 96, ликвор – 4, биоптаты из разных локализаций – 4, плевральный экссудат – 1), полученных от 228 больных, находившихся на лечении в отделениях клинической иммунологии, онкогематологии и химиотерапии РДКБ, стационаре МНПЦБТ, в городских клинических больницах №№ 12,15. Также анализировали музейные штаммы и выделенные от больных культуры туберкулезного комплекса (M.

tuberculosis H37Rv АТСС25618, M. bovis Ravenel СПбНИИФ, M. bovis BCG СПбНИИФ) и нетуберкулезных микобактерий (M. avium ГИСК, M. avium АТСС35712, M. intracellulare Астрахань МНПЦБТ, M. intracellulare ГИСК, M.

intracellulare АТСС35761, M. scrofulaceum АТСС35787, M. scrofulaceum Астрахань МНПЦБТ, M. chelonae ГИСК, M. fortuitum ГИСК, M. kansasii ГИСК). Наряду с этим исследовали штаммы кислотоустойчивых микобактерий (n=62) и комплекса M.

tuberculosis (n=4), выделенные от больных с подозрением на туберкулез, находящихся на лечении в МНПЦБТ, после посева биологического материала на плотные среды в центральной бактериологической лаборатории (ЦБЛ), а также бронхоальвеолярный лаваж (n=18), полученный от ВИЧ-инфицированных больных, находившихся на лечении в Московском центре борьбы со СПИДом Департамента здравоохранения города Москвы.

Сбор материала, хранение, выделение ДНК и детекцию для «Нестед-ПЦР», «МАIS-диф» проводили согласно методическим рекомендациям, разработанным в МНПЦБТ [Скотникова О.И. и др., 2001]. Для тест-систем «ТУБ-ДИФ» (ИМГ РАН, Россия), «Cobas Amplicor MTB» (Roche, Швейцария), «Нарвак Nested-PCR» (НПО «Нарвак», Россия), «Нарвак RT-PCR» (НПО «Нарвак», Россия) проводили согласно протоколам, предложенным фирмами-производителями.

Для определения ДНК туберкулезного комплекса применяли тест-системы «Сobas Аmplicor» (Roche, Швейцария) и «Нестед-ПЦР» (МНПЦБТ, Россия).

Определение вида микобактерий, входящих в M. tuberculosis complex Тест-система «Нарвак Nested-PCR» («Н-ПЦР»), созданная в НПО «Нарвак», представляет собой двухступенчатую, так называемую «нестед» модификацию метода ПЦР с использованием внутренних и внешних праймеров [Гребенникова Т.В.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»