WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 ||

Функционализация поверхности монолитного слоя (биочипа) или проточной колонки (диска) осуществлялась одним из аффинных партеров выбранных пар (МАт против ТТР и СИТР). Метод прямой иммобилизации белков, широко используемый для модификации поверхности монолитных дисков, был перенесен на формат непроточных слоев. Для этого чип, имеющий активную часть в виде слоя сорбента размером 25180.2 мм, погружался в раствор лиганда (Таблица 10). Для иммобилизации СИТР и МАт против ТТР на поверхности макропористых монолитных сорбентов (дисков) использовали: 1. прямую одностадийную иммобилизацию СИТР в статических условиях; 2. иммобилизацию МАт против ТТР с использованием однократной гидравлической подачи шприцом раствора белка в поры с последующей длительной инкубацией реакционной смеси в статических условиях. Количество ковалентно связанного с поверхностью сорбента СИТР совпало с данными, полученными при иммобилизации того же лиганда на поверхности непроточного слоя биочипа (Таблица 10). Этот факт может являться косвенным подтверждением сходства морфологии монолитных сорбентов, полученных в процессе фото- и термополимеризации. В то же время, количество иммобилизованных МАт против ТТР на поверхности тонкого ГМА-ЭДМА слоя оказалась практически в три раза меньше такового, полученного при гидравлическом способе введения того же лиганда в поровое пространство диска. Очевидно, что при статическом способе иммобилизации лиганда проникновение молекул лиганда в поры сорбента и внутрипоровое движение молекул к эпоксидным группам, локализованным на стенках пор, лимитируется медленной стадией диффузии, что приводит к потере некоторой доли связываемого лиганда.

Методом скоростного фронтального анализа на монолитных ГМА-ЭДМА дисках были определены характеристики связывания иммобилизованного аффинного лиганда с нативным белком-партнером и модифицированной аналогичным белком латексной частицей. Результаты динамических экспериментов, представленые далее в Таблице 10, сравнивались с аналогичными характеристиками, полученными на биочипе с использованием специально разработанного метода. С целью оптимизации процедуры анализа на чипе, а именно, оптимизации времени, необходимого для аффинного взаимодействия иммобилизованного лиганда с растворенным комплементом, проводили серию экспериментов, направленных на изучение адсорбции анализируемых веществ на поверхности модифицированного лигандом диска в статических условиях. Биоспецифическая адсорбция комплемента имела место при погружении диска с иммобилизованными МАт против ТТР на 15 и 90 минут в растворы различных концентраций ТТР или полимерных наночастиц, модифицированных ТТР. Для достижения в статических условиях величины динамической адсорбционной емкости сорбента по отношению к наночастицам потребовалось гораздо больше времени, а именно, 90 минут (Таблица 10). Этот факт можно объяснить очень медленной диффузией вирусоподобных частиц в пределах жесткого макропористого пространства в отсутствии конвективного потока.

Количественный анализ образования аффинных пар СИТР-ТР и МАт-ТТР, осуществляемый на биочипе Характеристики аффинного связывания (максимальная адсорбционная емкость Qmax и термодинамическая константа диссоциации аффинных комплексов Kdiss) в формате биочипа с участием нативных белков (ТТР и ТР) определялись по разработанной для этого методике и сравнивались с параметрами, полученными для наночастиц, функционализированных теми же белками. В случае аффинной пары МАт - ТТР использовался непрямой «сэндвич» метод (ИФА), тогда как СИТР - ТР комплекс оценивался прямым методом с использованием флюоресцентного (ФЛА) и ферментного маркеров (ИФА). Процесс аффинного связывания комплементов происходил в течение 15 минут как для случая прямого, так и «сэндвич» методов. Это время было рассчитано для толщины ГМА-ЭДМА слоя в биочипе (0.2 мм), которая в 7.5 раз была меньше половины толщины монолитного диска (1.5 мм), где проникновение вещества из раствора в поровое пространство в статических условиях (в течение 90 минут, см. выше) происходит в двух направлениях, т. е. как снизу, так и сверху погруженного в раствор диска. И действительно, в формате биочипа выбранное время проникновения анализируемых веществ (белков и более крупных частиц) и реализации аффинной адсорбции оказалось достаточным, что позволило получить близкие значения адсорбционной емкости в сравнении с емкостью, детектируемой в случае использования аффинных дисков (Таблица 10).

Количественное определение содержания целевого компонента осуществлялось методом твердофазной денситометрии (в УФ и видимой области спектра, соответственно) относительно калибровочной прямой построенной с использованием растворов белка или наночастиц известной концентрации. Линеаризация экспериментальных изотерм адсорбции позволила получить параметры аффинного связывания (Таблица 10). Неполное соответствие величин аффинного связывания (Таблица 10), полученных для пары МАт-ТТР в двух рассматриваемых форматах биоанализа (динамической режим ВЭМДАХ и биочип), можно объяснить различием схем образования аффинного комплекса, а именно прямого способа комплексообразования в проточной системе и комплексообразования с использованием «сэндвич» метода в непроточном варианте.

Таблица Определение параметров связывания для модельных аффинных пар в двух форматах Аффинная пара МАт-ТТР СИТР-ТР Параметры ВЭМДАХ Биочип Биочип ВЭМДАХ Динамическая Статическая ИФА ФЛА ИФА х10-17, глобул белка/мл 33.0 9.0 0.7 0.7 0.сорбента kdiss(СИТР-TР)х107, M 2.0 2.5 1.0 1.1 1.0 0.Q’max(TР)х102, глобул белка/глобулы лиганда 3.8 1.2 (15 мин) 1.6 15.0 14.0 5.Q’’max (ПС-TР)х105, 2.0 (15 мин) частиц/глобулы лиганда 7.0 6.0 (90 мин) 3.0 7.2 7.3 4.(1) Q’max = (Q max/ M) x NA / (2) Q”max = (Q max/ Q*)/, где Q*= q/N Q’ max - максимальная адсорбционная емкость сорбента, количество десорбируемого белка (мг), рассчитанное из данных фронтального анализа; Q’’max - количество белка (мг), рассчитанное с использованием формул (1) и (2); M - молекулярная масса белка; NA - число Авогадро; Q* - количество белка (мг), ковалентно связанное с 1 нансферой; q – суммарное количество белка, иммобилизованное на поверхности всех наносфер в растворе; N - количество наносфер в растворе; – концентрация аффинных лигандов. Стандартное отклонение при линеаризации изотерм адсорбции 0.9745-0.9987 (Origin).

Предел чувствительности для пары МАт - ТТР составил 7.1х107 модифицированных ТТР наночастиц на спот. В случае другой аффинной пары (СИТР-ТР) при использовании флуоресцентного маркера наблюдалось практически полное совпадение характеристик аффинного связывания, полученных в двух рассматриваемых форматах (Таблица 10). Предел чувствительности для этого варианта анализа составил 9.8х107 модифицированных конъюгатом ТР-ФЛ наночастиц на спот. Несколько более низкие значения данных параметров, а именно 2.1х107 модифицированных конъюгатом ТР-ПХ наночастиц на спот, были получены для этой же аффинной пары при использовании ферментной метки (Таблица 10), что, вероятно, может быть связано со стерическими ограничениями при образовании аффинного комплекса СИТР-ТР, которые создает молекула пероксидазы хрена, существенно превосходящая в размерах глобулу трипсина. Тем не менее, значение константы диссоциации для этой аффинной пары хорошо согласуются в проточном и непроточном форматах монолитного сорбента.

Таким образом, оптимальная поровая структура монолитного слоя в непроточном формате обеспечивает возможность эффективных аффинных взаимодействий с участием крупных объектов. Полученные данные подтверждают предположение о сходстве адсорбционного поведения наночастиц в двух сравниваемых в данном разделе форматах монолитных поверхностей. Как прямой, так и непрямой - «сэндвич» - методы анализа могут быть рекомендованы для применения в диагностике вирусных инфекций.

2.2.5.2. Обнаружение вирусов гриппа в биологических образцах с использованием разработанной тест-системы на основе биочипов Разработанная стратегия анализа вирусоподобных частиц в формате биочипа легла в основу создания микротест-систем, предназначенных для ранней диагностики гриппа.

Предварительные эксперименты с использованием «сэндвич» метода анализа биологических жидкостей, содержащих вирусы гриппа А или В, показали удовлетворительные результаты. Однако с целью сокращения времени анализа использовали прямой метод детектирования, а также оптимизировали процедуру анализа, в частности, время иммобилизации биологических образцов (вирусов). Отсутствие окрашивания зон с иммобилизованными контрольными образцами и достаточная чувствительность (0.2 гае), достигаемая за два часа иммобилизации, позволила перейти к решению более сложных задач, а именно к ранней диагностики вирусов гриппа. На основе результатов анализа клинического материала 83 пациентов, который параллельно тестировался классическими методами диагностики вируса гриппа, были получены следующие характеристики разработанной тестсистемы: чувствительность – 80 и 93 %; специфичность – 61 и 83 % для вирусов А и В, соответственно. Следует заметить, что данные, полученные на предлагаемом нами биочипе, соответствуют средним характеристиками известных тест-систем при значительном сокращении времени анализа.

Выводы 1. Впервые получены физико-химические модели вирусов с использованием диальдегидной сшивки белка и ковалентной модификации реакционноспособной поверхности наносфер белками и другими лигандами, имитирующими компоненты вирусной оболочки.

2. Методом высокоэффективной ионообменной и аффинной хроматографии на ультракоротких монолитных колонках проведен сравнительный анализ адсорбционного поведения нативных белков (овальбумина, трипсина, соевого ингибитора трипсина, транстиретина) и модельных наночастиц на их основе; показано, что адсорбция модельных частиц определяется природой и количеством привитого лиганда.

3. Впервые сконструирована модельная система, имитирующая адсорбционное взаимодействие вируса с клеткой; методом скоростной аффинной хроматографии на монолитах установлено влияние микроокружения на характеристики биоспецифического связывания вирусоподобных наночастиц с поверхностью сорбента.

4. Разработаны и оптимизированы оригинальные методы формирования биокомплементарной адсорбционной поверхности монолитной стационарной фазы для прямого выделения вируса гриппа из сложных биологических смесей; путем подбора наиболее эффективного лиганда, а также вариацией методов иммобилизации лиганда на поверхности сорбента предложен псевдо-аффинный скоростной вариант хроматографического выделения вируса гриппа А из биологических образцов.

5. На примере двух модельных аффинных пар белков (моноклональные антитела против транстиретина-транстиретин и соевый ингибитор трипсина-трипсин) разработан метод количественного определения вирусоподобных частиц в формате полимерных биочипов; апробирован макет биочипа, предназначенный для нанодиагностики вирусов гриппа А и В.

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

1. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Evseeva, A. Menshikova, E. Vlakh, T. Tennikova. Study of dynamic adsorption behavior of large-size protein-bearing particles // J. Chromatogr. A 2007.

V. 1144. № 1. P. 40-47.

2. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Tennikova. Macroporous monolithic layers as efficient 3-D microarrays for quantitative detection of virus-like particles // Anal. Chem. 2007. V. 79. № 14.

P. 5173-5181.

3. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Tennikova. Development of a new strategy of influenza virus separation based on pseudo-affinity chromatography on short monolithic columns // Anal.

Chem. 2008, V. 80. № 6. P. 2188-2198.

4. I. Kalashnikova, E. Vlakh, T.Evseeva, A. Menshikova, T. Tennikova, Study of dynamic adsorption behavior of large-size protein bearing particles, in: Book of abstracts of the 5th International Symposium “Molecular Mobility and Order in Polymer Systems”, Saint-Petersburg, Russia, 2005, P. 116.

5. И. В. Калашникова, Н. Д. Иванова, А. Ю. Меньшикова, Т. Б. Тенникова, Изучение динамической адсорбции укрупненных белковых молекул в условиях хроматографии на монолитных сорбентах, в: Сборник тезисов II Санкт-Петербургской конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах», Санкт-Петербург, Россия, 2006, Ч. 3, С. 89.

6. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Evseeva, A. Menshikova, T. Tennikova, Study of dynamic adsorption behavior of virus-mimiking synthetic particles bearing different protein at their outer surface, in: Book of abstracts of Monolith Summer School (MSS 2006) “Application in biochromatography, bioconversion and solid phase synthesis”, Portoroz, Slovenia, L19, P.26.

7. I. Kalashnikova, N. Ivanova, M. Slabospitskaya, T. Tennikova, Use of microarray approach for quantitative detection of virus-like particles, Monolith Summer School (MSS 2006) “Application in biochromatography, bioconversion and solid phase synthesis”, Portoroz, Slovenia, 2006, http://www.monoliths.com/library/pdf/posters/Kalashnikova_MSS_06.pdf.

8. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Tennikova, New generation of bioanalytical microarrays for quantitative detection of human viruses, in: Book of abstracts of the “International Congress on Analytical Sciences”, ICAS-2006, Moscow, Russia, 2006, P. 249.

9. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Tennikova, S. Ilisavsky, Development of novel approach using monolithic sorbents for quantitative isolation of influenza viruses, in: Book of abstracts of the young scientists and students international scientific conference “Modern problems of microbiology and biotechnology”, Odessa, Ukraine, 2007, P. 87.

10. I. Kalashnikova, N. Ivanova, T. Tennikova, Development of microarray approach for diagnostics of influenza viruses, in: Book of abstracts of the young scientists and students international scientific conference “Modern problems of microbiology and biotechnology”, Odessa, Ukraine, 2007, P. 102.

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»