WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

Невысокая адсорбционную емкость БСА- и ЦП-носителей (Таблица 6) можно объяснить эффектом экранирования большей части иммобилизованных низкомолекулярных лигандов, обусловленным большими размерами спейсерных белков. В отличие от спейсеров-белков, сополимер (Рис. 4 ё), имеющий в составе боковой сахаридный остаток, проявлял собственное сродство к гемагглютинину. При этом, однако, сополимер не был инертен по отношению к другим компонентам вакцины, поэтому промежуточный шаг элюирования солевым буфером являлся обязательным в случае использования данного макромолекулярного лиганда. Таким образом, все сконструированные аффинные носители позволяли селективно выделять гемагглютинин из гриппозной вакцины. Введение промежуточного спейсера между низкомолекулярным лигандом и поверхностью жесткой полимерной матрицы продемонстрировало положительную тенденцию к увеличению адсорбционной емкости аффинных сорбентов.

Сравнительный анализ адсорбционного поведения на формируемых носителях синтетических моделей вируса гриппа и реального вируса гриппа Очередная задача в данном экспериментальном разделе заключалась в конструировании модельных частиц, имитирующих вирус гриппа, а также сравнительном анализе адсорбционного поведения вируса гриппа и его модели с использованием наиболее эффективных биораспознающих систем (СИТР-СЛА и СИТР-С-СЛА). Сферический вирион вируса гриппа с диаметром 80-120 нм имеет снаружи двойной слой липидов, в котором закреплены три вирусных белка, большую часть из которых составляет гемагглютинин (HА).

В качестве основы для конструирования модели такого вируса были выбраны полисти рольные монодисперсные наносферы диаметром 80 нм, содержащие на поверхности реакционноспособные аминогруппы. Данные группы полимерных частиц позволили осуществить связывание с карбоксильными группами гемагглютинина посредством их активации водорастворимым карбодиимидом. Именно такое экспонирование молекул НА на поверхности полимерных частиц, не затрагивающее сигнальный пептид белка на N-конце полипептидной цепи, являлось адекватным природной локализации гемагглютинина в составе вирусной частицы. Сравнение параметров аффинного взаимодействия вируса гриппа А (H1N1) и его функциональной модели с аффинными лигандами осуществлялось с использованием количественных результатов, полученных методом фронтального элюирования (Таблица 7).

Таблица Количественные данные адсорбции вируса гриппа А и его модели, полученные из результатов фронтального анализа Вирус гриппа А ПС-НА Диск СИТР-С-СЛА СИТР-СЛА СИТР-СЛА 1.4 0.6 0. Qmax 0.141 0.109 0.Q х 10-12 2.0 1.6 1.9* Титр 20 20 (1) Q = (Q max х К/ M)/ (2) Q* = Q max/ Q’, где Q’= q/N Q – адсорбционная емкость сорбента, частиц/мл сорбента, рассчитанное с использованием формул (1) и (2) ; Qmax – максимальная адсорбционная емкость сорбента, количество десорбируемого белка НА (мг/мл сорбента), рассчитанное из изотерм адсорбции; К – значение отношения количества молекул гемагглютинина в вирионе, к общему количеству молекул белка в вирионе, равное 0.74; M – молекулярная масса белка; - количество молей гемагглютинина на вирион;

Q’– количество белка (мг), ковалентно связанное с 1 наносферой; q – суммарное количество белка, иммобилизованное на поверхности всех наносфер в растворе; N - количество наносфер в растворе; – концентрация аффинного лиганда (СЛА мкмоль/мл сорбента); Титр – количество гемагглютинирующих единиц в мл (гае/мл), полученное тестом на гемагглютинацию. Стандартное отклонение при трехкратном воспроизведении аффинной ВЭМДХ составило ± 7%.

На данном этапе также исследовалась возможность эффективного использования тестируемых аффинных матриц для селективного выделения вируса гриппа непосредственно из биологического материала, представляющего собой фильтрат аллантоисной жидкости куриных эмбрионов. Оптимизированные хроматографические условия, используемые для выделения гемагглютинина из вакцины, были перенесены на выделение вируса гриппа и его моделей. Количественная оценка белка в десорбированных фракциях осуществлялась методом Лоури. Идентичность хроматограмм (Рис. 5) и невероятная близость значений адсорбционной емкости сорбента, выраженной в частицах на мл сорбента (Таблице 7), свидетельствует о том, что созданная модель вируса на основе латекса близка к оригиналу как по геометрическим размерам, там и по функциональным свойствам.

(б) (а) Условия: 1 – загрузка растворов вируса гриппа (а) с концентрацией 0.50 мг белка или полимерных наносфер (б), модифицированных гемагглютинином, с концентрацией 0.03 мг белка в мл 0.05 M натрий ацетатного буфера (pH 6.2) на аффинный диск, модифицированный СИТР-СЛА; 2 – элюирование неспецифически связанных компонентов образца 0.4 M и 2.0 M NaCl в 0.01 M PBS буфере (pH 6.5), и 3 – десорбция вируса гриппа или модельных частиц 200 с использованием 12.5 M натрий-боратного буфера (рН 10.7). Скорость элюции: 2 мл/мин.

1 2 1 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 t (мин) t (мин) Рис. 5. Хроматограммы двух образцов, вируса гриппа А (а) и его модельных частиц (б), полученные на аффинном диске, модифицированным СИТР-СЛА.

UV (mAu) UV (mAu) Тест на гемагглютинирующую активность подтвердил, что в десорбируемых фракциях действительно содержался вирус гриппа, а метод культивирования вируса в клетках почки собаки (MDCK) показал, что выделенный предложенным методом вирус сохраняет свою целостность структуры и, следовательно, биологическую активность. Важным результатом хроматографии частиц на монолитных стационарных фазах является чрезвычайно малое для аффинного варианта разделения время одного пробега (Рис. 5).

Разработка метода селективного выделения вирионов вируса гриппа А с использованием псевдо-аффинного варианта хроматографии на монолитах. Функционализация монолитных сорбентов Как упоминалось ранее, более высоких величин адсорбционной емкости для крупных объектов можно добиться увеличением объема сорбента и удалением низкомолекулярного лиганда от поверхности полимерной матрицы. Другим подходом, способным увеличить производительность хроматографического процесса, основанного на аффинных взаимодействиях, может являться подбор наиболее эффективных лигандов и оптимизация условий их иммобилизации. Попытка реализовать подобный способ увеличения продуктивности сепарационной системы была предпринята в серии экспериментов с вирусом гриппа. В данном случае были получены аффинные носители с различными вариациями иммобилизованных лигандов, проявляющих собственное специфическое сродство к вирусу гриппа. На Рис. 6 а-г представлены аффинные матрицы, полученные с использованием выбранных лигандов.

Рис. 6. Схемы модификации поверхности ГМА-ЭДМА монолитных дисков (б) -2,6сиалиллактозой (СЛ), (а) -метилтрицикло[3.3.1.1\3,7]декан-1-метанамином (ремантадин), (в) гепарином, а также (г) хитозаном и сиалиллактозиламином или -2,6-сиалиллактозой.

Метод зонального элюирования: скоростная псевдо-аффинная хроматография на монолитных фазах Полученные аффинные сорбенты (Таблица 8) тестировали методом зонального элюирования. Объектом исследования являлся вирусный материал (вирус гриппа А H1N1), культивируемый в клетках почки обезьяны (VERO). Проводимые эксперименты имели целью оптимизацию условий адсорбции вируса из неочищенного биологического материала и разработки оптимального метода его десорбции. Согласно данным гемагглютинирующего теста, максимальная активность вируса была зафиксирована в области рН 6.0-7.0, а изменение концентрации буфера в пределах 0.05-1.0 M не оказывало влияния на его активность. Поэтому 0.05 M ацетатный буфер (pH 6.2) использовался на этапе адсорбции вируса. Для этого фиксированный объем раствора с концентрацией 1.1 мг белка/мл в 0.05 M ацетатном буфере (pH 6.2) наносился на каждый из рассматриваемых сорбентов. Вирус, адсорбированный на монолите, функционализированным гепарином, полностью десорбировался при использовании 0.4 M NaCl (Tаблица 8) в 0.01 М PBS буфере (рН 6.5), что подтверждалось данными гемагглютинирующего теста. Для других аффинных носителей, вирус был обнаружен только во фракциях, десорбированных 0.2 M NaOH. Следует отметить, что высокое значение рН буфера, используемого для десорбции, было немедленно приведено к нейтральному значению.

Таким образом, относительный анализ фракций, десорбированных с различных функционализированных поверхностей монолитных носителей по результатам теста на гемагглютинирующую активность позволил сравнить эффективность предложенных лигандов. Согласно представленным результатам (Таблица 8), наилучшие адсорбционные возможности продемонстрировали два аффинных носителя, содержащие в качестве лигандов -2,6-сиалиллактозу, и хитозан, модифицированный -2,6-сиалиллактозой.

Таблица Характеристики аффинных матриц, использованных для выделения вируса гриппа Лиганд Титр – концентрация аффинного лиганда Ремантадин 459.0±22.0 (моль/мл сорбента); титр – количество ге Хитозан 0.3±0.01 магглютинирующих единиц в мл (гае/мл).

-2,6-СЛ 17.0±0.5 27 СЛА–сиалиллактозиламин, СЛ–-2,6-сиалиллактоза.

Хитозан-СЛ 2.3±0.1/13.0±0.5 Хитозан-СЛА 1.0 ±0.05/18.5±1.0 Гепарин 1.6±0.05 Метод фронтального элюирования Дальнейшие хроматографические эксперименты с использованием метода фронтального элюирования и оптимизированных условий адсорбции и десорбции вируса позволили количественно оценить максимальную величину адсорбционной емкости, которая может быть получена на каждой из двух выбранных аффинных матриц, модифицированных СЛ и хитозан-СЛ, соответственно. Наличие вируса в десорбируемых фракциях анализировали тестом на гемагглютинацию, а количественную оценку белка в десорбируемых фракциях осуществляли с помощью БCA-микротеста. Линеаризация экспериментальных изотерм адсорбции позволила определить максимальную адсорбционную емкость каждого носителя (Qmax), выраженную в мг белка/мл (Таблица 9). Величина титра определяется именно гемагглютинином вируса гриппа, который способен агглютинировать эритроциты, поэтому значение адсорбционной емкости было пересчитано в более адекватные единицы (частицы/мл сорбента). В отличие от результатов зонального анализа (Таблица 9), которые показали сходство адсорбционной активности дисков с сиалиллактозой, иммобилизованной напрямую на поверхности сорбента и через реакцию связывания с хитозаном, значе ния адсорбционной емкости этих же дисков, полученные методом фронтального элюирования, как и титр вируса в десорбируемых фракциях, различались в 2.5 раза (Таблица 9).

Таблица Количественные данные фронтального элюирования вируса гриппа А (1) Q = ((Q max х К)/ M)/ Параметры Лиганды Q – адсорбционная емкость сорбента, количество частиц/мл сорбента, рассчитанное с использованием формулы (1); Qmax – максимальная ад СЛ хитозан - СЛ сорбционная емкость сорбента, количество десорбируемого белка 17.0 13. (мг/мл сорбента), рассчитанное из данных фронтального анализа; К – Qmax 0.2 0.значение отношения количества молекул гемагглютинина в вирионе к Q x 10-12 2.8 6.9 общему количеству молекул белка в вирионе, равное 0.74; M – молекулярная масса белка; - количество моль гемагглютинина на вирион.

Титр 27 Cтандартное отклонение при линеаризации изотерм адсорбции 0.99800.9981 (Origin).

Вероятно, в случае аффинного носителя с иммобилизованной сиалиллактозой одинаковое количество аффинных сайтов оказалось активным по отношению к вирусу гриппа вне зависимости от наносимого на носитель объема, а следовательно, количества образца.

Согласно полученным данным, наибольшее количество вирионов вируса гриппа с сохранением их природной патогенности удалось выделить с использованием аффинного монолитного носителя, модифицированного последовательно хитозаном и -2,6сиалиллактозой.

2.2.5. Диагностика вирусов гриппа А и В с использованием ГМА-ЭДМА монолитного сорбента в виде непроточных слоев (биочипов) Методология, основанная на процессах биологического распознавания, может быть использована в методе скоростной хроматографии на монолитах для очистки и выделения вирусов. Создание биораспознающих систем в формате непроточных слоев (биочипов), сохраняющих ту же химическую природу монолитного сополимера и геометрию его поровой структуры, а также природу биологических лигандов и методы их введения в структуру поверхности, предоставляет иные практические возможности (скриннинговые тесты в медицинских целях, диагностика вирусных инфекций). В условиях отсутствия потока в формате биочипа именно дизайн порового пространства полимерного носителя в случае работы с вирусами должен обеспечивать как свободное проникновение частиц внутрь трехмерного порового пространства сорбента, так и достаточную адсорбционную емкость носителя.

Создание микроаналитических слоев на основе ГМА-ЭДМА монолита В отличие от описанного выше ГМА-ЭДМА макропористого монолита, синтезируемого методом термоинициируемой свободно-радикальной полимеризации и используемого для хроматографии, ультратонкие ГМА-ЭДМА слои получали фотополимеризацией. Оптимизация условий фотоинициируемой полимеризации позволила получить макропористые ГМА-ЭДМА сополимеры в виде трехмерных тонких слоев с морфологическими свойствами, близкими к свойствам ГМА-ЭДМА монолитных дисков.

Согласно разработанному методу, создание биочипов на основе ГМА-ЭДМА монолитного сополимера включает в себя несколько стадий: (1) подготовка стеклянной подложки, формирование оперативной ячейки; (2) введение методом силанизации в структуру стекла двойных связей, способных участвовать в последующей сополимеризации с ГМА и ЭДМА мономерами; (3) формирование монолитного полимерного слоя методом фотоинициируемой полимеризации.

2.2.5.1. Разработка алгоритма диагностики на биочипе на примере модельных частиц Апробацию биочипов проводили с использованием двух аффинных пар: моноклональные антитела против транстиретина (МАт) - транстиретин (ТТР), и соевый ингибитор трипсина (СИТР) - трипсин (ТР). Для детектирования аффинных комплексов использова лись методы иммуноферментного и флюоресцентного анализа. Введение флуоресцентной метки в молекулу белка подразумевало реакцию связывания аминогрупп белка с флюорескамином (ФЛ). Образование конъюгата ТР (или МАт) с пероксидазой хрена (ПХ), согласно классическому методу, осуществлялось с использованием перийодатного окисления полисахаридных цепей фермента с образованием активных альдегидные групп, способных далее вступать в реакцию с аминогруппами биологических молекул. С использованием выбранных модельных белков (ТР и ТТР) или их конъюгатов (ТР-ФЛ и ТР-ПХ) были получены функционализированные наночастицы на основе полистирольных карбоксилированных наносфер размером 80 нм.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»