WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

Таблица Данные фронтального анализа, полученные для различных форм трипсина (ТР) и соевого ингибитора трипсина (СИТР) в аффинном варианте ВЭМДХ Лиганд х10-7, моль/ Комплемент Q max, Q’max x10-13, мл сорбента мг белка/мл глобул или частиц/ сорбента мл сорбента СИТР 0.26 ± 0.02 660 (1) ТР 0.К-СИТР (R = 11.6 нм) 1.58 ± 0.02 31 (1) ПС-СИТР 0.40 ± 0.02 1.4 (2) ТР 0.38 ± 0.02 950 (1) СИТР 1.К-TР (R = 15.6 нм) 0.09 ± 0.02 0.3 (1) ПС-TР 0.21 ± 0.02 0.5 (2) (1) Q’max = (Q max/ M) х NA (2) Q’max = Q max/ Q’, где Q’= q/N Q max - максимальная адсорбционная емкость сорбента, т. е. количество адсорбированного белка (мг), рассчитанное из данных фронтального анализа; Q’ max - количество белка (мг) рассчитанное с использованием формул (1) и (2); M - молекулярная масса; NA - число Авогадро; Q’ - количество белка (мг), ковалентно связанное с 1 наносферой; q – суммарное количество белка, иммобилизованного на поверхности всех наносфер в растворе; N - количество нано сфер в растворе.

2.2.3. Моделирование взаимодействий вирус-клетка Известно, что помимо белков-антигенов, участвующих во взаимодействии вирусклетка, в состав оболочки вирусов входят и другие компоненты, такие как липиды и угле воды, которые могут вносить дополнительный вклад в механизм адсорбционных взаимодействий вируса с поверхностью сорбента. Поэтому дальнейшие экспериментальные шаги были направлены на постепенное усложнение микроокружения белка на поверхности наночастиц, приближая его к составу вирусной оболочки. Основой для создания вирусоподобных частиц служили два типа полимерных карбоксилированных наносфер на основе полистирола (ПС) и полиметилметакрилата (ПММА) размерами 63.5 и 80 нм, соответственно. В наших экспериментах с ПММАД частицами находящийся в поверхностном слое декстран имитировал олигосахаридную составляющую микроокружения. Роль моделируемого вирусного антигена выполнял белок трипсин. Фосфатидилэтаноламин (ФТЭА) и глюкозамин (ГА) были выбраны в качестве низкоспецифических лигандов, отвечающих за липидную и углеводную составляющие микроокружения белка, воссоздаваемого на поверхности синтетических наночастиц. Ковалентную иммобилизацию аминосодержащих лигандов на поверхности наносфер, содержащих реакционноспособные карбоксильные группы, осуществляли согласно ранее упомянутому методу с использованием водорастворимого карбодиимида. Таким образом, были получены частицы, содержащие один или несколько лигандов различной природы и специфичности.

Те же фосфолипид и углевод (ФТЭА и ГА) использовались для построения приближенной структуры наружной клеточной мембраны на поверхности ГМА-ЭДМА сорбента.

Аффинный партнер трипсина, СИТР, на поверхности сорбента выполнял роль моделируемого клеточного рецептора. Концентрация выбранных аминосодержащих лигандов, иммобилизация которых осуществлялась одностадийной реакцией их ковалентного связывания с эпоксидными группами сорбента, представлена как в Таблице 5. Таким образом, модификацией поверхности латексных наночастиц и монолитного сорбента была получена упрощенная биокомплементарная система, представленная на Рис. 3. Использование в данной системе аффинной пары СИТР-ТР в качестве модельной взаимодействующей пары «рецептор-антиген» позволило осуществить контроль аффинного распознавания при построении модели взаимодействий «вирус – клетка».

Количественное исследование биоспецифического связывания комплементов (СИТР-ТР), выполняемое в условиях скоростной аффинной хроматографии с использованием метода фронтального элюирования, позволило оценить влияние микроокружения на адсорбционную емкость сорбента и термодинамическую устойчивость образующихся аффинных комплексов (Таблица 5). При этом сравнивались два экспериментальных случая (Рис. 3), а именно, (1) когда осуществлялась иммобилизация единственного белка, СИТР, на поверхности сорбента, и (2) когда два выбранных компонента (ФТЭА и ГА) одновременно формировали микроокружение данного белка на поверхности монолитной фазы, тем самым, приближая ее к поверхности клетки, атакуемой вирусом.

ГМА-ЕДМА - ПММАД наносфера монолитный диск - ПС наносфера - глюкозамин - фосфатидилэтаноламин (1) (ФТЭА) - трипсин (2) - соевый ингибитор трипсина Рис. 3. Варианты исследования биоспецифического связывания.

Предварительно были проведены хроматографические эксперименты, в которых участвовали монолитный сорбент, с ковалентно присоединенным СИТР, а также находя щиеся в подвижной фазе ПММАД и ПС частицы, модифицированные ФТЭА (68.2% заполнение поверхности) или ГА (57.1% заполнение поверхности). Результаты данных экспериментов подтвердили наличие неспецифических взаимодействий обсуждаемых липидных и сахаридных лигандов с поверхностью ГМА-ЭДМА-СИТР полимера.

Из данных Таблицы 5 очевидно, что постепенное усложнение поверхностной структуры наносфер приводило к снижению их адсорбции на поверхности сорбента, модифицированного единственным белком. Данный результат можно объяснить как стерическими факторами, так и наличием связей различной природы, способных конкурировать со специфическим взаимодействием лиганд - комплемент.

Кардинально противоположная ситуация наблюдалась в процессах адсорбции частиц с разным поверхностным составом на многокомпонентной поверхности сорбента (Таблица 5). За исключением наносфер, модифицированных только трипсином, где число адсорбированных наночастиц снижалось более чем в два раза по сравнению с адсорбцией на монолите, модифицированным единственным лигандом - СИТР, адсорбционная емкость (Qmax) с тонкой подстройкой поверхностного микроокружения белка в худшем случае практически не изменялась, а в лучшем - увеличивалась (Таблица 5).

Таблица Количественные характеристики аффинного взаимодействия, полученные методом фронтального анализа Комплемент Заполнение Лиганд(ы) поверхности СИТР СИТР-ГА-ФТЭА наносфер Q’max х 10-5, K’diss х 106, Q’max х 10-5, K’diss х 106, лигандом, частиц/глобулы М чаcтиц/глобулы М % лиганда лиганда ПС-ТР 48.4 7.2 1.0 3.3 1.ПС-ТР-ГА 43.1/37.5 2.5 0.6 4.2 0.ПС-ТР-ФТЭА 45.0/36.0 2.1 0.6 3.1 0.ПС-ТР-ГА-ФТЭА 1.4 1.4 1.5 0.41.9/11.7/44.ПММАД-ТР 1.2 3.8 1.6 9.66.Обозначения: ПС _ полистирольные карбоксилированные наносферы; ПММАД _ полиметилметакрилатные карбоксилированные наносферы, стабилизированные декстраном; СИТР_ соевый ингибитор трипсина; ТР _ трипсин; ФТЭА _ фосфотидилэтаноламин; ГА _ глюкозамин.

(1) Q’max = (Q max/Q)/, где Q= q/N (2) K’diss= (K/Q)х 1/NА Обозначения: Q max - максимальная адсорбционная емкость, количество белка (мг), рассчитанное из результатов фронтального анализа; Q’max - максимальная адсорбционная емкость, рассчитанная по формуле (1); NA - число Авогадро; Q - количество белка (мг), связанное с одной наносферой; q - суммарное количество белка (мг), связанное со всеми наносферами, находящимися в растворе; N - количество наносфер в растворе; - концентрация лигандов, иммобилизованных в единице объема сорбента; K’diss - константа диссоциации аффинного комплекса, рассчитанная по формуле (2); К – константа, найденная из линеаризованных в координатах 1/Q – 1/С изотерм адсорбции. Стандартное отклонение при линеаризации изотермы адсорбции 0.9895-0.9987 (Origin).

В случае частиц ПС-ТР увеличившееся значение константы диссоциации комплекса (K’diss) показывало, что микроокружение лиганда на поверхности сорбента вносило некоторый вклад в дестабилизацию аффинного комплекса. Наличие аминосахара на поверхности частиц ПС-ТР-ГА практически никак не отразилось на величине константы диссоциации аффинного комплекса, образующегося в условиях микроокружения СИТР из трех компонентов разной природы. Вероятно, именно липидная составляющая в составе ПСТР-ФТЭА и ПС-ТР-ГА-ФТЭА частиц придавала дополнительную прочность аффинному комплексу по сравнению с упрощенной формой взаимодействия. В случае частиц ПММАД-ТР полисахаридные цепи, по-видимому, ингибировали связывание вирусоподобных частиц со сложной поверхностью сорбента, поскольку значение константы диссоциации увеличилось почти в 2.5 раза (Таблица 5), хотя данное снижение прочности комплекса не повлияло заметно на величину адсорбционной емкости. В данном случае можно говорить скорее о псевдо-аффинной адсорбции с более слабой энергией взаимодействия комплементов. Хотя полученные результаты представляют определенный научный интерес относительно комплексообразования белков, окруженных функциональными лигандами отличной специфичности, с практической точки зрения, т. е. при конструировании эффективных биораспознающих сепарационных систем, можно сделать вывод о возможности использования традиционных аффинных сорбентов с единственным иммобилизованным лигандом.

2.2.4. Разработка стратегии эффективного метода выделения и очистки вируса гриппа с использованием псевдо-аффинного варианта хроматографии на монолитах Полученные на ранних этапах исследования экспериментальные данные позволили далее осуществить сравнение адсорбционного поведения модельных вирусоподобных частиц с реальным вирусным объектом с использованием тех же методов и сорбентов. В качестве объекта исследования был выбран вирус гриппа.

Построение модели вируса гриппа Одна из задач, решаемых в данном экспериментальном разделе, заключалась в изучении адсорбционного комплексообразования основного антигена вируса гриппа – гемагглютинина (HA) - с целью его выделения из гриппозной вакцины с последующим использованием чистого продукта для построения адекватной модели данного типа вируса. Известно, что сиаловая кислота (N-ацетил-нейраминовая кислота) концевых участков олигосахаридных цепей гликолипидов и гликопротеинов, расположенных на поверхности клеточных мембран, служит гемагглютинин-связывающим рецептором, провоцирующим проникновение вируса в клетку. Интенсивно исследуемая в настоящее время сиалиллактоза в виде двух изомерных форм, а именно, -2,3- и -2,6-сиалилпроизводные лактозы, была выбрана в качестве потенциального биоспецифического лиганда.

Оптимизация методов ковалентного связывания выбранного лиганда с поверхностью ГМА-ЭДМА носителей Очевидно, что стерическая доступность для взаимодействия с вирусом небольшого по размерам лиганда - сиалиллактозы, будет иной в сравнении с крупными лигандами, каковыми являются белки. Конформация сиалового производного, необходимая для специфического связывания с антигеном вируса, может претерпевать изменения в ходе иммобилизации на поверхности жесткой матрицы. Поэтому для максимально эффективного экспонирования на поверхности сорбента данного лиганда и сохранения его биологической функции использовались различные способы иммобилизации. Предварительно, в структуру сиалиллактозы методом аминирования вводились реакционноспособные аминогруппы.

В результате использования всех, приведенных на Рис. 4 а-ё, подходов к иммобилизации аминопроизводного сиалиллактозы был получен ряд аффинных носителей с различным количеством лиганда на поверхности сорбента (Таблица 6).

Рис. 4 а-ё. Различные способы иммобилизации аффинного лиганда (СЛА) на поверхности ГМА-ЭДМА монолитного диска.

Сравнительное изучение эффективности аффинных сорбентов на примере выделения гемагглютинина из гриппозной вакцины В качестве источника основного антигена вируса гриппа гемагглютинина использовалась вакцина Грипповак, состав которой представлял собой смесь контаминантных и вирусных белков (общий белок – 2100 мкг/мл, овальбумин – 0.04 мкг/мл, гемагглютинин вируса А – 19.2 (Н1) и 18.8 (Н3) мкг/мл, гемагглютинин вируса гриппа В – 25.6 мкг/мл). Для сравнения полученных ранее носителей раствор вакцины с концентрацией 1 мг белка/мл в ацетатном буфере (pH 6.0) пропускался со скоростью подвижной фазы 2 мл/мин через каждый из шести приготовленных монолитных дисков (Таблица 6) до полного насыщения адсорбционных сайтов сорбента. Элюция раствором соли, предшествующая десорбции, осуществлялась с целью удаления неспецифически адсорбированных белков вакцины. Десорбцию специфически связанного с лигандом НА проводили путем резкого изменения рН буфера в сторону щелочных или кислых значений. Было показано, что наиболее полная десорбция достигалась при использовании натрий-боратного буфера, pH 10.7, приводя к полному разрушению комплекса и высвобождению чистого искомого продукта - гемагглютинина. Данный результат подтверждался методом электрофореза в 15% полиакриламидном геле (ПААГЭ).

Низкая эффективность носителя (Таблица 6), напрямую модифицированного аминированной сиалиллактозой (Рис. 4 а) наиболее вероятно связана с обсуждаемыми ранее стерическими препятствиями при образовании комплекса с участием белка большого размера, каким является гемагглютинин. Этот факт указывает на то, что структурного спейсера, а именно, лактозного кольца длиной 1 нм, недостаточно для обеспечения беспрепятственного взаимодействия НА с СЛА. Кроме того, при относительно невысокой концентрации привитого прямым методом низкомолекулярного лиганда велика вероятность его локализации в малых порах, недоступных для проникновения белка. В конечном счете, максимальное связывание гемагглютинина наблюдалось на сорбенте с СЛА, иммобилизованным с участием спейсера СИТР (Рис. 4 в). Носитель СИТР-С-СЛА несколько уступал предыдущему в эффективности связывания искомого белка (Таблица 6). При равной концентрации аффинного лиганда на поверхности носителей СИТР-С-СЛА и А-СИТР-СЛА (Таблица 6) величина адсорбционной емкости последнего оказалась в три раза ниже полученной на носителе СИТР-С-СЛА. Такой результат, вероятно, связан с изменением морфологии сорбента в ходе его модификации, протекающей в достаточно агрессивных условиях.

Таблица Концентрация лиганда сиалиллактозы и адсорбционная емкость сорбентов, полученная при выделении гемагглютинина из гриппозной вакцины СЛА ЦП СИТР- А-СИТР- СИТР- БСА- Поли(МАГ-ВП СЛА СЛА С-СЛА СЛА АК)-СЛА 15.7±0.8 0.8±0.05 0.6±0.05 1.4±0.1 1.4±0.1 3.5±0.2 5.1±0. Q x 102 0.7±0.05 7.9±0.5 26.6±1.0 5.1±0.5 16.0±0.5 1.2±0.1 1.0±0. – концентрация СЛА, мкмоль/мл сорбента; Q – адсорбционная емкость, моль HA/моль СЛА, %; СЛА – сиалиллактозиламин, ЦП – церулоплазмин, СИТР-СЛА – соевый ингибитор трипсина, модифицированный сиалиллактозиламином, А-СИТР-СЛА – соевый ингибитор трипсина, иммобилизованный на альдегидсодержащей поверхности сорбента и далее модифицированный сиалиллактозиламином, СИТР-С – сукцинилированный соевый ингибитор трипсина, модифицированный сиалиллактозиламином, БСА-СЛА – бычий сывороточный альбумин, модифицированный сиалиллактозиламином, поли(МАГ-ВП-АК)-СЛА – сополимер 2-деокси-N-метакриламино-D-глюкозы с N-винилпирролидоном и акролеином, модифицированный сиалиллактозиламином.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»