WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Таблица Характеристики полистирольных наночастиц (ПС), модифицированных соевым ингибитором трипсина (СИТР), трипсином (ТР) и овальбумином (ОВА) Частица Nmax, максимальное число глобул белка, связанных с Заполнение поверхности поверхностью 1 наносферы наносфер белком, % Теория Эксперимент ПС-СИТР 1600 700 ПС-ТР 1600 1100 700 300 ПС-ОВА 700 400 2.2. Исследование особенностей динамической адсорбции модельных частиц методом высокоэффективной монолитной дисковой хроматографии (ВЭМДХ) Скоростная хроматография на ультракоротких монолитных колонках (дисках) с различной поверхностной функциональностью являлась основным методом исследования адсорбционного поведения наночастиц, полученных двумя описанными выше методами. Использование хорошо изученных белков в качестве сигнальных при формировании вирусоподобных частиц предоставляет исключительные возможности сравнения адсорбционного поведения в динамических условиях нативных белков и крупных наночастиц на их основе.

Материал использованных в работе монолитных носителей, выполненных в форме дисков размером 12х3 мм (CIM® Disks, BIA Separations, Любляна, Словения), представляет собой жесткий макропористый сополимер глицидилметакрилата (ГМА) и этиленгликольдиметакрилата (ЭДМА) (60 и 40 мол.%, соответственно), получаемый методом свободнорадикальной полимеризации в блоке. Используемые носители характеризовались следующими параметрами: средний размер пор – 1.5 мкм, удельная площадь поровой поверхности – 10-15 м2/г, общая пористость – 0.6 мл/мл сорбента, объем диска – 0.34 мл.

2.2.1. Ионообменная ВЭМДХ модельных частиц Метод зонального элюирования С целью изучения влияния скорости потока подвижной фазы на адсорбцию крупных частиц на функционализированной поверхности монолитных сорбентов использовался метод зонального элюирования. При этом на колонку (диск) с различной скоростью потока подвижной фазы наносились фиксированные объемы растворов наночастиц, модифицированных овальбумином, определенной концентрации. Известно, что для эффективного разделения время пребывания частицы в массе сорбента (tres) должно значительно превышать время ее внутрипорового диффузионного движения (tfilm). Рассчитанное минимальное время пребывания наночастицы в слое сорбента при скорости потока 6 мл/мин соответствовало 2 секундам и превышало время внутрипоровой диффузии, составляющее всего 0.1 секунды (Таблица 2). Таким образом, даже для исследуемых крупных частиц скорость потока подвижной фазы равная 6 мл/мин удовлетворяла требованию tres >> tfilm. Следовало бы ожидать, что уменьшение времени пребывания частицы в массе сорбента должно привести к пропорциональному уменьшению числа вероятных контактов частиц с адсорбционными центрами сорбента в единицу времени, что в свою очередь, вызывает снижение адсорбционной емкости. Однако проведенные опыты показали, что уменьшение времени пребывания наночастицы в массе сорбента в шесть раз сопровождалось уменьшением адсорбционной емкости сорбента только в 3.8 раза (Таблица 2).

Таблица Результаты зонального метода анализа, полученные для наносфер, модифицированных овальбумином (ПС-ОВА), в ионнообменном варианте ВЭМДХ Скорость потока, tпреб, tдиф, Количество элюируемых ПС-ОВА, мл/мин сек сек мг белка/мл сорбента 1.0 12 0.6 0.200 ± 0.3.0 4 0.2 0.085 ± 0.6.0 2 0.1 0.053 ± 0.Подобный результат является подтверждением теории конвекционного механизма массопереноса в высокопроницаемых пористых системах. И действительно, рассчитанное с использованием уравнения e = v0 l/3 (v0 – конвективная скорость потока и l – длина разделительного слоя) значение кажущейся диффузивности e, равное 4х10-5 см2/сек, на три порядка превышает значение свободной диффузии в растворе латексных частиц De 6х10-см 2/сек, полученное независимым физическим методом (метод диффузии).

Метод фронтального элюирования Количественная оценка влияния скорости потока подвижной фазы на максимально возможную величину адсорбционной емкости анионообменных сорбентов осуществлялась методом фронтального элюирования. В этом варианте через сорбент (CIM DEAE Disk) пропускали растворы наночастиц, модифицированных соевым ингибитором трипсина (СИТР), различной концентрации до полного насыщения всех адсорбционных сайтов сорбента. В соответствии с законами хроматографии на монолитах, где величина адсорбции вещества не зависит от скорости потока подвижной фазы, экспериментальные изотермы, полученные при скоростях 1, 3 и 10 мл/мин, оказались практически идентичными. Соответственно, величина максимальной адсорбционной емкости диска, определяемая графически линеаризацией изотерм адсорбции в обратных координатах 1/Q – 1/С, для крупных частиц остается постоянной при разных скоростях элюции. Кроме того, в процессе экспериментов была выявлена зависимость объема пробы, наносимого до полного насыщения адсорбционных центров сорбента, от скорости потока подвижной фазы. Вероятно, некоторая доля крупных частиц, ввиду их малой диффузионной подвижности, при высоких скоростях элюции способна «проскакивать» сквозь стационарную фазу без взаимодействия с ней, а увеличение объема наносимой пробы при возрастании скорости потока компенсирует уменьшение числа эффективных контактов.

С использованием скорости потока 3 мл/мин осуществлялось исследование влияния размеров модельных наночастиц на величину максимальной адсорбционной емкости. Линеаризация полученных методом фронтального элюирования изотерм адсорбции позволила получить значения максимальной адсорбционной емкости (Qmax, Таблица 3).

Таблица Значения максимальной адсорбционной емкости (Qmax) различных форм овальбумина (ОВА) и соевого ингибитора трипсина (СИТР) (ионообменные CIM диски) Белок Образец R, Qmax, Q’max x 10 -14, нм мг белка/мл сорбента глобул или частиц/мл сорбента Нативный 2.0 28.7 ± 0.05 7200 (1) Конъюгат 1 8.7 7.9 ± 0.03 67 (1) СИТР Конъюгат 2 15.6 2.3 ± 0.03 0.7 (1) ПС-СИТР (44%) 42.0 0.2 ± 0.02 0.1 (2) Нативный 3.0 30.0 ± 0.03 4020 (1) Конъюгат 8.7 1.7 ± 0.02 14.6 (1) ОВА ПС-ОВА (44%) 43.0 1.3 ± 0.02 0.4 (2) ПС-ОВА (56%) 43.0 1.7 ± 0.02 0.6 (2) (1) Q’max = (Q max/ M)*NA (2) Q’max = Q max/ Q’, где Q’= q/N Q max - количество десорбируемого белка (мг), рассчитанное из данных фронтального анализа; Q’ max - количество белка (мг), рассчитанное с использованием формул (1) и (2); M - молекулярная масса белка; NA - число Авогадро; Q’ – количество белка (мг), ковалентно связанное с 1 наносферой; q – суммарное коли-чество белка, иммобилизованное на поверхности всех наносфер в растворе; N – количество наносфер в растворе.

Согласно вычисленным значениям Qmax, в ряду нативный белок - конъюгат белка – модифицированные белком полимерные наносферы наблюдалось естественное снижение этой величины. Подтверждением того, что адсорбция анализируемых частиц определялась ионной природой белка, может служить пропорциональное увеличение максимальной адсорбционной емкости при увеличении количества белка (овальбумина), иммобилизованного на поверхности полимерных частиц (Таблица 3). Тем не менее, даже невысокие для крупных частиц значения адсорбционной емкости монолитного сорбента, особенно в сравнении со значениями, полученными для нативных белков, превосходят емкости, зафиксированные с использованием мембранных адсорберов или сорбентов гелевого типа.

Одним из возможных путей увеличения производительности монолитного сорбента может быть увеличение его объема. Действительно, при увеличении объема сорбента втрое наблюдалось практически пропорциональное увеличение максимальной адсорбционной емкости для полимерных наносфер, модифицированных овальбумином; при этом оперативное давление изменялось крайне незначительно, что позволяло использовать те же высокие скорости элюции, как и в случае одной сепарационной единицы.

Разделение модельных смесей (градиентная анионообменная ВЭМДХ) Абсолютная идентичность картин разделения в одинаковых условиях градиентной АО ВЭМДХ пар двух модельных белков (овальбумина и трипсина) и соответствующих модифицированных латексов (Рис. 1 а и б) подтвердила доминирующее участие белка в адсорбции сформированных частиц на ионогенной поверхности сорбента. Следует отметить, что разделение смеси конъюгатов (Рис. 1 в) в идентичных условиях градиента оказалось затруднительным. Время выхода с колонки конъюгата овальбумина (К-ОВА) (Рис. в) заметно уменьшилось по сравнению с нативным белком (Рис. 1 а), что свидетельствует об уменьшении суммарного отрицательного заряда в результате сшивки глобул.

Таким образом, доказано, что в ионообменном варианте хроматографии адсорбция наночастиц, несущих белки на внешней поверхности, определяется ионной природой бел ка и, как правило, подчиняется тем же законам, что и адсорбция нативных белков. Другим важным результатом, полученным в данной серии экспериментов, является подтверждение пригодности морфологии используемой монолитной стационарной фазы для реализации скоростных процессов адсорбционного разделения частиц, значительно превосходящих по размеру исследованных ранее крупных биологических объектов, таких как белки и ДНК.

(а) (б) (в) 100 25 100 O B A =1.=2.1 K- T P, K - O B A =2.T P K- O B A 80 20 80 K- T P ПС- O B A 60 60 15 60 B (%) B (%) B (%) K - O B A ПС- T P K- T P 40 40 10 40 20 20 5 0 0 0 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,t (мин) t (мин) t (мин) Условия: 12x3 мм CIM® QA диск; модельные пары: (а) ОВА (2.0 мг/мл) - ТР (3.0 мг/мл); (б) ПС-OВА (0.1 мг белка/мл) – ПС-ТР (0.1 мг белка/мл); (в) К-ОВА (0.2 мг/мл) – К-ТР (0.4 мг/мл); cкорость потока подвижной фазы: мл/мин; подвижная фаза: 20 мM Трис–HCl, pH 7.6 (буфер А), 1M NaCl в 20 мM Трис–HCl буфере, pH 7.6 (буфер В);

объем петли составлял 400 мкл; градиент: 0-1 мин – 0% B; 1-1.02 мин от 0 до 10% B; 1.02-2.02 мин – 10% B; 2.022.04 мин от 10 до 20% B; 2.04-3.04 мин – 20% B; 3.04 – 3.06 мин от 20 до 100% B; 3.06 – 4 мин – 100% B; 4-4.02 мин от 100 до 0% B; 4.02-5 мин – 100% A.

Рис. 1. Хроматографическое разделение методом АО ВЭМДХ на CIM QA диске пар двух модельных белков (а), соответствующих модифицированных латексов (б) и пар двух конъюгатов белков (в).

2.2.2. Поведение вирусоподобных частиц в условиях биоаффинной адсорбции на поверхности монолитных фаз (ВМДАХ) Исследование адсорбции, основанной на принципе биокомплементарного связывания в условиях сквозного потока жидкости (аффинная хроматография на монолитных фазах), является адекватным инструментом про поверхность верки способности создаваемых частиц, сосорбента держащих белок на внешней поверхности, к биокомплементарному связыванию. Наблюдаемый положительный эффект может служить доказательством сохранности третичной - трипсин - полимерная наносфера структуры белка, независимо от способа его - соевый ингибитор трипсина укрупнения. Изучение характеристик биоафРис. 2. Варианты анализа аффинной адсорбфинного связывания в ряду нативный белок – ции производных СИТР И ТР.

конъюгат белка – модифицированные белком латексные наночастицы проводилось с использованием модельной аффинной пары соевый ингибитор трипсина – трипсин (СИТР-ТР). При этом были реализованы две возможные ситуации локализации партнеров (Рис. 2). Ковалентное связывание СИТР с поверхностью сорбента осуществлялось при высоких значениях рН (9-10), при которых эпоксидная группа наиболее вероятно взаимодействует с боковыми -аминогруппами остатков лизина.

Иммобилизация ТР осуществлялась с использованием водорастворимого карбодиимида через предварительное аминирование поверхности монолитного носителя.

Зональное элюирование Серия экспериментов, подобная разделениям в ионообменном варианте ВЭМДХ, была выполнена в режиме аффинной хроматографии, где исследовалось адсорбционное A (280nm) A (280 нм) A (280 нм) поведение полимерных наночастиц, поверхностно-модифицированных трипсином. При этом роль аффинного партнера выполнял соевый ингибитор трипсина, иммобилизованный на поверхности монолитного сорбента. В данном варианте хроматографии шестикратное увеличение скорости потока подвижной фазы вызывало уменьшение адсорбционной емкости сорбента в 2.5 раза. Как уже обсуждалось ранее, конвекционный поток подвижной фазы сквозь проницаемый слой сорбента увеличивает эффективную диффузионную подвижность частиц, характеризуя происходящие динамические адсорбционные процессы как конвекционно-контролируемые. Именно этим объясняется возможность использования высоких скоростей элюирования в варианте более сложной адсорбции, отличающейся от ионной гораздо более низкой поверхностной концентрацией лигандов и, как следствие, меньшим числом эффективных контактов между комплементарными молекулами. Наиболее важно, что аффинная адсорбция крупных частиц в условиях потока подвижной фазы подчиняется абсолютно тем же закономерностям, наблюдаемым ранее для белков, обладающих гораздо меньшими размерами и, соответственно, бльшими коэффициентами внутрипоровой диффузии.

Фронтальный анализ Для количественной оценки теоретически возможной адсорбционной емкости аффинных сорбентов, Qmax, использовался метод фронтального элюирования. Как и в ионообменной хроматографии, величина Qmax уменьшалась с увеличением размера анализируемых объектов и не зависела от скорости потока подвижной фазы (Таблица 4). Как следует из Таблицы 4, заметная разница в значениях адсорбционной емкости сорбента для конъюгатов К-ТР и К-СИТР, по всей вероятности, обусловлена снижением биологической активности трипсина вследствие затрагивания ответственных за поддержание активной конформации -аминогрупп лизина при сшивке глобул ГДА, имеющей место при щелочных значениях рН. Интересно отметить, что процесс десорбции укрупненных комплементов происходил в тех же достаточно жестких условиях, как и в случае пар, образованных индивидуальными белками (рН 2.0). Данный факт является подтверждением прочности формирующихся биокомплементарных комплексов, т. е. идентичности их констант диссоциации с константами нативных комплексов.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»