WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Как видно из рисунка 7, при увеличении температуры инкубации с антигеном до о P 37P C, значения флуоресцентных сигналов от гелевых ячеек с иммобилизованными на микрочипе антителами увеличиваются. Необходимо отметить, что фоновый сигнал при всех температурах оставался постоянным. В дальнейших экспериментах для увеличения чувствительности анализа инкубацию на микрочипах проводили при температуре 37°С.

Одностадийный сэндвич-иммуноанализ РЭА на микрочипах Для практических приложений важно, чтобы протокол проведения анализа был наиболее простым. Разработанный ранее протокол проведения сэндвич-анализа включал две стадии: инкубацию антигена с иммобилизованными на микрочипе антителами (17 ч) и связывание проявляющих флуоресцентно меченых антител с образованным на микрочипе бинарным комплексом (2 ч). После каждой стадии необходимо производить отмывку микрочипов от неспецифически сорбировавшегося белка. Для упрощения процедуры анализа объединили в одну стадию инкубацию микрочипа с антигеном и флуоресцентно мечеными антителами. Смесь каждой из концентраций антигена с проявляющими о P антителами инкубировали на микрочипе в течение 17 ч при 37P С. В результате было обнаружено, что такой протокол проведения анализа позволяет не только добиться результатов, сравнимых с двустадийным анализом, но и повысить чувствительность анализа (рис. 8).

Рис. 8. Сравнение калибровочных кривых сэндвич-иммуноанализа РЭА:

(1) одностадийный анализ; (2) двустадийный анализ.

Увеличение чувствительности анализа можно объяснить увеличением времени взаимодействия антигена с проявляющими антителами. Ранее было показано, что константа ассоциации иммобилизованных антител (СЕА-1) с антигеном существенно выше константы ассоциации РЭА с проявляющими антителами (СЕА-10). Увеличение времени взаимодействия антигена с проявляющими антителами с двух часов до семнадцати часов позволило добиться увеличения сигнала.

Сэндвич анализ РЭА в сыворотках крови С использованием микрочипов, содержащих иммобилизованные антитела СЕА-1, получили калибровочную кривую для РЭА в диапазоне концентраций от 0 нг/мл до нг/мл. На аналогичных микрочипах по полученной калибровочной кривой провели определение концентраций РЭА в трех образцах сывороток крови. Эксперимент проводили в 5-и повторах. В качестве референсных значений использовали значения концентраций РЭА в этих же образцах, измеренные с помощью ИФА набора фирмы СanАg (Швеция).

Калибровочная кривая с нанесенными на неё величинами интенсивности флуоресцентного сигнала от образцов сывороток крови представлена на рис. 9. Для точек, соответствующих образцам сывороток крови, по оси абсцисс отложены значения концентраций, измеренных ИФА; по оси ординат отложены значения флуоресцентных сигналов, полученные на микрочипах, указаны стандартные отклонения.

Рис. 9. Сэндвич-иммуноанализ сывороток, содержащих РЭА, - точки, соответствующие образцам сывороток крови Как видно из рисунка, данные, полученные на микрочипах и с помощью ИФА, хорошо коррелируют между собой. Таким образом было показано, что методом сэндвичиммуноанализа на микрочипах можно определять значение концентраций антигена в клиническом образце.

Ускорение иммуноанализа на микрочипе с помощью механического перемешивания образца Микрочипы, используемые для анализа, должны удовлетворять двум условиям:

давать возможность анализировать низкие концентрации вещества, при этом анализ должен занимать минимально возможное время.

Кинетические исследования показали, что взаимодействие антигена с иммобилизованными на микрочипе антителами происходит довольно медленно, сигнал не выходит на насыщение даже за 40 ч (рис.5). Скорость кинетики насыщения определяется величиной константы ассоциации образуемого бинарного комплекса «иммобилизованное антитело-антиген» и скоростью диффузии антигена. Эта стадия является лимитирующей при проведении иммуноанализа на микрочипе. Для уменьшения времени диффузии и, следовательно, времени проведения анализа было выбрано механическое перемешивание образца на микрочипе. Для этого была разработана специальная камера, содержащая две микротрубочки для подвода раствора образца (рис. 10А), а также был модифицирован перистальтический насос для совершения возвратно-поступательных движений, что позволило перемешивать исследуемый образец без существенного увеличения объема.

А Б Рис. 10. (А) - фотография камеры для перемешивания. (Б) - схематический рисунок камеры.

На микрочипе с иммобилизованными антителами СЕА-1 были получены кинетические кривые реакции образования комплекса «антиген-иммобилизованное» антитело с флуоресцентно меченым РЭА (С = 200 нг/мл) для диффузионно-реакционной кинетики (без перемешивания) и кинетики, ускоренной при помощи перистальтического насоса.

Реакционную смесь общим объемом 225 мкл, содержащую РЭА-Cy5, заливали в камеру через встроенные трубки при помощи пипетки, причем 75 мкл смеси находилось в камере, а оставшиеся 150 мкл распределены между трубками. Если эксперимент проводился без перемешивания, то трубки герметично замыкались друг на друга.

Флуоресцентный сигнал от каждого гелевого элемента измеряли с выдержкой 1 сек с интервалом в 60 сек в течение всего эксперимента. Для перемешивания реакционной смеси в камере встроенные трубки присоединяли к модифицированному перистальтическому насосу Minipulse 2 (Gilson, France). Перемешивания реакционной смеси достигали автоматическим переключением направления потока с прямого на обратное каждые 2 сек. Скорость потока в камере варьировали от 2 до 7 мл/мин. Все эксперименты для данной концентрации антигена и данной скорости потока проводились дважды. Результаты эксперимента представлены на рис. 11.

Как видно из рисунка, время выхода на насыщение флуоресцентного сигнала уменьшается с 90 ч (без перемешивания) до 25 ч (с перемешиванием).

Рис. 11. Кинетика образования бинарного комплекса флуоресцентно меченного РЭА с иммобилизованными антителами: (1) с перемешиванием образца; (2) без перемешивания образца.

Кроме того, было показано, что при увеличении скорости перемешивания время выхода на насыщение также уменьшается, т.е. даже при максимально возможной скорости потока (~ 7 мл/мин) не происходит механической денатурации белкового комплекса и вымывания антигена из ячеек микрочипа. Поэтому в дальнейшей работе использовали максимальную из доступных скоростей перемешивания образца.

Получение калибровочных кривых при проведении анализа с механическим перемешиванием образца Разработанную систему перемешивания образца на микрочипе использовали для получения калибровочных кривых при проведении одностадийного сэндвичиммуноанализа РЭА. В качестве контроля в этом же эксперименте были получены калибровочные кривые для одностадийного сэндвич-иммуноанализа РЭА без перемешивания инкубационной смеси. Для одновременного перемешивания нескольких образцов камеры соединяли последовательно, а исследуемые образцы разделяли воздушной пробкой, таким образом, на каждом микрочипе реакции с перемешиванием проходили в одних и тех же условиях (температура, скорость, время). На рис.представлены калибровочные кривые, полученные при перемешивании образца и без перемешивания. Инкубацию образцов на микрочипах проводили равное количество времени.

Рис. 12. Калибровочные кривые иммуноанализа РЭА: (1) с перемешиванием образца;

(2) без перемешивания образца.

Как видно из рисунка, перемешивание образца приводит к значительному возрастанию флуоресцентных сигналов, при этом не происходит увеличения фонового сигнала. Проведенные исследования показали, что использование системы перемешивания позволяет значительно сократить время анализа без потери чувствительности.

Выводы:

1. Разработан метод получения трехмерных гидрогелевых белковых микрочипов на основе полимеризационной иммобилизации, позволяющий проводить иммобилизацию белка без его предварительной модификации.

2. Продемонстрировано сохранение исходной биологической активности иммобилизованных на микрочипах белков на примере белка барназы и антител.

3. Продемонстрирована возможность проведения прямого масс-спектрального полуколичественного анализа белков на гидрогелевых микрочипах.

4. Разработана процедура одностадийного сэндвич-иммуноанализа ракового эмбрионального антигена, позволяющая с высокой чувствительностью определять содержание данного онкомаркера в растворах и сыворотках крови.

5. Разработана система ускорения анализа с помощью механического перемешивания образца на микрочипе.

Публикации автора 1. Рубина А.Ю., Паньков С.В., Иванов С.М., Дементьева Е.И. и Мирзабеков А.Д.// Белковые микрочипы. //Доклады Академии Наук, 2001, N5, том. 381, C. 701-704.

2. A.Yu. Rubina, E.I. Dementieva, A.A. Stomakhin, E.L. Darii, S.V. Pan’kov, V.E. Barsky, S.M. Ivanov, E.V. Konovalova, and A.D. Mirzabekov. Hydrogel-based protein microchips:

manufacturing, properties, and applications. //Biotechniques 34: 1008–1022 (May 2003).

3. Дементьева Е.И., Рубина А.Ю., Стомахин А.А., Иванов С.М., Крейндлин Э.Я., Иванов Д.С., Родин Д.В., Деев С.М., Прасолов В.С. и Мирзабеков А.Д. Белковые микрочипы:

анализ экспрессии рекомбинантного Барстара. //Доклады Академии Наук, 2003, N1, том. 393, C. 116-120.

4. D.A. Zubtsov, S.M. Ivanov, A.Yu. Rubina, E.I. Dementieva, V.R. Chechetkin, A.S.

Zasedatelev. Effect of mixing on reaction-diffusion kinetics for protein hydrogel-based microchips. //Journal of Biotechnology 122: 16-27 (2006).

5. Иванов С.М., Рубина А.Ю. Разработка методов иммобилизации белков в гелевых микрочипах. Тезисы докладов и стендовых сообщений ХVI зимняя молодежная научная школа школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Москва, 9-12 февраля 2004г. С. 17-18.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»