WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Было обнаружено, что биологическая активность модифицированной барназы зависит от количества метакрильных групп, введенных в молекулу белка перед иммобилизацией. Введение пяти и менее непредельных групп (ряд 3,4) практически не влияет на способность барназы связывать барстар, в то время как введение 9 групп (ряд 2), т.е. модификация всех возможных аминогрупп барназы, приводит к полной потере активности. В качестве контроля использовали ячейки, не содержащие иммобилизованной барназы (ряд 1).

1 2 3 3.2.1.0.1 2 3 Рис.1 Оценка сохранения активности барназы с различной степенью модификации: (1) ячейки, не содержащие иммобилизованной барназы; (2) ячейки, содержащие барназу с непредельными группами; (3) ячейки, содержащие барназу с 5 непредельными группами;

(4) ячейки, содержащие барназу с 1 непредельной группой.

Таким образом, проведенные исследования показали, что при модификации белка введением непредельных групп в достаточно широком диапазоне (от 1 до 5) не происходит потери биологической активности необходимо выбирать мягкие условия проведения реакции (боратный буфер, pH 9.3, 30 мин при комнатной температуре, молярное отношение белка к реагенту от 1/1 до 1/5), позволяющие вводить в белок такое количество непредельных групп, при котором иммобилизуемая молекула не теряет своей активности.

Метод полимеризационной иммобилизации Следующей задачей было упростить метод изготовления белковых микрочипов, исключив стадию предварительной модификации белка.

При исследовании иммобилизации барназы в гелях было обнаружено, что немодифицированный белок также способен в небольшой степени (2-3%) иммобилизоваться. Известно, что при синтезе полимеров методом радикальной полимеризации, независимо от способа ее инициирования (фотохимическое, термическое, радиационное или химическое), реакция протекает через стадии инициирования, роста и обрыва цепи. Такая природа радикальной полимеризации создает благоприятные условия для включения в структуру полимера различных соединений, в том числе, белков, содержащих в своей структуре амино-, сульфгидрильную или другие активные группы.

Возможны, по меньшей мере, два пути включения: участие в реакции передачи цепи с образованием активных радикалов и участие в реакции нуклеофильного присоединения к ненасыщенным соединениям, существующим на разных стадиях полимеризации, а именно, к исходным мономерам, растущим ненасыщенным макрорадикалам и ненасыщенным макромолекулам.

При изготовлении сополимеризационных микрочипов, когда белки иммобилизованы за счет предварительного введения в их структуру непредельных групп, были использованы гели на основе акриламида с pH полимеризационной смеси 7.0-7.2. Затем было проведено исследование взаимодействия барназы с различными гелеобразующими мономерами в условиях, при которых частично депротонированы -аминогруппы лизина.

Реакцию проводили в боратном буфере при pH 9.5, температуре 22°С, время реакции 12 ч, при перемешивании. Молярное отношение белка к модифицирующим реагентам составляло 1/1000. После проведения реакции белок очищали гель-фильтрацией на спинколонке с сефадексом G-25. Количество молекул мономера, введенных в одну молекулу белка, определяли с помощью MALDI TOF MS анализа (табл. 1).

Таблица 1. Оценка взаимодействия барназы с различными мономерами гидрогеля.

Название мономера Количество Структурные формулы введенных мономеров групп акриламид метакриламид N,N’-метиленбисакриламид N,N’-метиленбисметакриламид (2-акрилоилоксиэтил)метакрилат N-(2-акрилоилоксоэтил)-метакриламид 4.N,N’-(1,2-дигидроксиэтилен)бисакриламид 1. Исходя из полученных данных, в качестве основного мономера был выбран метакриламид, не взаимодействующий в данных условиях с аминогруппами белка и, соответственно, не выводящий активные группы белка из последующей реакции сополимеризации. В качестве сшивающего бифункционального агента был выбран N,N’метиленбисакриламид. При большом избытке гелеобразующих мономеров по отношению к иммобилизуемому белку, а именно такой избыток в смеси для полимеризации, в результате алкилирования -аминогруппы лизина в белок вводится одна из непредельных групп бифункционального агента, в то время как вторая непредельная группа остается свободной и принимает участие в формировании растущей полимерной структуры.

Состав полимеризационной смеси Т4%С2,5% (где Т% – суммарная масса всех гелеобразующих мономеров к объему геля, С% – отношение веса сшивки к суммарному весу всех гелеобразующих мономеров) был выбран таким образом, чтобы максимально повысить пористость получаемого гидрогеля.

При подобранных условиях для изготовления сополимеризационных микрочипов была получена эффективность иммобилизации белков, сравнимая с эффективностью иммобилизации, получаемой при использовании метода с предварительной модификацией белковых молекул. Было показано, что эффективность иммобилизации не зависит от размера молекулы белка, а в большей степени определяется структурой и аминокислотным составом (таблица 2).

Таблица 2. Эффективности иммобилизации различных белков Белок Мол. масса (кДа) Эффективность иммобилизации (%) Иммуноглобулины IgG 150 60-L-Аспартат аминотрансфераза 90 Бычий сывороточный альбумин 67 Пероксидаза 44 Белок А 42 -лактоглобулин 18 барназа 12 70- Исследование ферментативной активности иммобилизованной на микрочипе барназы Белок барназа – внеклеточная рибонуклеозид-3’-трансфераза. Барназа специфична по отношению к рибо-G-нуклеотидам, но также способна с меньшей эффективностью расщеплять и другие рибонуклеотиды (рибо-U).

Для проверки ферментативной активности барназы, иммобилизованной на микрочипе, олигонуклеотиды состава 5’-TTGAA-(рибо-G)-ACT-3’и 5’-TTTT-(рибо-UUU)TTTTT-3’ наносили на гелевые ячейки микрочипа индивидуально, каждый на отдельную о P ячейку. После инкубации (Т 22P С) микрочипа был проведен прямой MALDI TOF MS анализ продуктов реакции непосредственно с ячеек микрочипа. В качестве отрицательного контроля использовали ячейки, не содержащие иммобилизованную барназу, на которые также наносили исследуемые олигонуклеотиды. Полное расщепление рибо-G-содержащего олигонуклеотида на ячейках с иммобилизованной барназой произошло менее, чем за 1 мин (рис. 2).

Рис. 2. Масс-спектральный анализ гидролиза 5’-TTGAA-(рибо-G)-ACT-3’ при комнатной температуре (1 мин), на микрочипе с иммобилизованной барназой: (1) спектр исходного олигонуклеотида, полученный с ячеек не содержащих барназу (контроль); (2) спектр продуктов гидролиза, полученный с ячеек с иммобилизованной барназой.

Гидролиз рибо-U-содержащего олигонуклеотида под действием иммобилизованной барназы протекал менее эффективно чем рибо-G олигонуклеотида, время прохождения реакции превышало несколько часов. При уменьшении температуры до 2°С наблюдали гидролиз рибо-G олигонуклеотида в течении 30 мин: уменьшался пик с массой, соответствующей исходному олигонуклеотиду (m/z 2750) и увеличивался пик с массой, соответствующей 5’-TTGAA-рибо-G фрагменту (m/z 1928) (рис.3).

Рис. 3. Масс-спектральный анализ гидролиза 5’-TTGAA-(рибо-G)-ACT-3’ при o P температуре 2P C, время инкубации: 2 (1), 5 (2), 20 (3) и 25 (4) мин.

Полученные данные позволяют сделать вывод, что иммобилизованная в гелевых элементах микрочипа барназа сохраняет не только ферментативную активность, но и субстратную специфичность.

Прямой масс-спектральный анализ барстара на микрочипах Для прямого масс-спектрального анализа барстара были изготовлены микрочипы с иммобилизованной в различных концентрациях (от 1 до 100 мкг/мл) барназой. После инкубации микрочипов с раствором барстара и отмывки от неспецифически сорбировавшегося белка, проводили элюирование в условиях, разрушающих комплекс, образованный барстаром с иммобилизованной барназой. Микрочип обрабатывали насыщенным раствором матрицы для МALDI TOF MS анализа (sinapinic acid) в растворе 10% муравьиной кислоты в 30%-ном водном ацетонитриле, выдерживали 20 мин при комнатной температуре во влажной камере, и затем высушивали на нагревательном о P столике при 40P С. Далее проводили прямой масс-спектральный анализ с каждого гелевого элемента микрочипа, и идентифицировали белок по его молекулярной массе и способности связываться с иммобилизованным лигандом (рис 4).

В результате было обнаружено, что наблюдается корреляция между абсолютной интенсивностью пиков молекулярных ионов барстара и концентрацией иммобилизованной барназы. Масс-спектры с гелевых ячеек, не содержащих иммобилизованную барназу, но инкубированных с раствором барстара, не содержали пиков, соответствующих молекулярной массе барстара.

Рис. 4. Прямой масс-спектральный анализ барстара на микрочипе с иммобилизованной барназой: (1) концентрация иммобилизованной барназы 100 мкг/мл (интенсивность I=21мВ); (2) концентрация иммобилизованной барназы 10 мкг/мл (интенсивность I=2.мВ); (3) концентрация иммобилизованной барназы 1 мкг/мл (интенсивность I=1.2 мВ).

Полученные данные свидетельствуют о возможности проведения прямого массспектрального полуколичественного анализа белков на гидрогелевых микрочипах. Такой анализ не требует введения флуоресцентной или другой метки в исследуемый белок, что особенно важно при анализе минорных белков в образцах, содержащих большое количество различных белков (сывороток крови, лизатов и др.). Данный тип анализа может быть полезен для проведения исследований в области протеомики.

Разработка процедуры сэндвич-иммуноанализа на белковых микрочипах (на примере РЭА) В клинической практике и научных исследованиях количественное определение многих белков выполняется с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), основанного на использовании специфических к исследуемому белку антител.

Для практических целей представлялось интересным разработать процедуру проведения иммуноанализа на белковых микрочипах.

Известно, что наиболее чувствительным из возможных типов иммуноанализа является сэндвич-иммуноанализ с использованием антител, специфичных к разным эпитопам белковой молекулы. В случае сэндвич-иммуноанализаB микрочип содержит B иммобилизованные антитела, реакционная среда (образец) содержит антиген, и на первой стадии происходит образование специфического бинарного комплекса антигениммобилизованное антитело. После завершения инкубации с антигеном и отмывки микрочипа от неспецифически связавшегося белка микрочип обрабатывают проявляющими флуоресцентно мечеными антителами, специфичными к другому эпитопу анализируемого антигена. Чем выше концентрация анализируемого соединения в образце, тем выше регистрируемый флуоресцентный сигнал. В результате получают график зависимости флуоресцентного сигнала гелевых элементов, содержащих антитела, от концентрации антигена в растворе (калибровочную кривую), по которой далее определяют неизвестную концентрацию антигена в исследуемом образце.

В качестве объекта для разработки иммуноанализа на микрочипах был выбран широко используемый серологический онкомаркер - раковый эмбриональный антиген (РЭА). Уровень РЭА при развитии опухолей различной локализации повышается в крови и отражает состояние злокачественного процесса. Падение уровня РЭА является показателем эффективности проводимого лечения, а вторичный подъем свидетельствует о развитии рецидива и метастазировании. РЭА представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 175-200 кДа. Одна из существенных особенностей его молекулярной структуры - высокое (до 60 %) содержание углеводов, что определяет высокую гетерогенность его физико-химических свойств.

Чтобы осуществить иммуноанализ на микрочипе, необходимо было выбрать пару специфических моноклональных антител к различным эпитопам РЭА, и определить, какие именно антитела должны быть иммобилизованы на микрочипе, а какие – выступать в качестве проявляющих. Для работы использовали пару моноклональных антител CEA-1 и CEA-10 (CanAg, Швеция), рекомендованную к использованию в стандартном варианте твердофазного иммуноферментного анализа на микропланшетах.

Были изготовлены микрочипы, содержащие ячейки с иммобилизованными антителами СЕА-1, СЕА-10 в равных концентрациях, и ячейки, не содержащие иммобилизованных белков (для контроля неспецифических взаимодействий). На микрочипе проводили кинетические измерения взаимодействия флуоресцентно меченого красителем цианиновым-5 (Су5, Amersham, Великобритания) антигена РЭА (концентрация 200 нг/мл) с иммобилизованными антителами. Как видно из кинетических кривых (рис. 5), образование бинарного комплекса РЭА-Су5 с иммобилизованными антителами СЕА-1 происходит значительно быстрее (интенсивность флуоресцентного сигнала прямо пропорциональна концентрации белкового комплекса), чем с иммобилизованными антителами СЕА-10.

Рис.5 Кинетические кривые взаимодействия иммобилизованных антител с флуоресцентно-меченным антигеном: (1) иммобилизованы антитела СЕА-1; (2) иммобилизованы антитела СЕА-10.

Поскольку концентрации иммобилизованных антител СЕА-1 и СЕА-10 одинаковы, то из формулы [AB] = КB [A][B], где концентрация комплекса пропорциональна B ass флуоресцентному сигналу, видно, что антитела СЕА-1 обладают большей аффинностью к антигену, чем антитела СЕА-10. Поэтому в качестве антител для иммобилизации были выбраны СЕА-1, а в качестве проявляющих антител были выбраны СЕА-10.

Для подтверждения правильности выбора пары антител был проведен также сэндвич-иммуноанализ РЭА на микрочипах с иммобилизованными антителами СЕА-1 и СЕА-10 в равных концентрациях. В качестве проявляющих антител использовали СЕА10-Су5 и СЕА-1-Су5 также в равных концентрациях. Полученные калибровочные кривые подтвердили правильность выбора пары антител для проведения сэндвич-иммуноанализа РЭА (рис. 6).

Рис.6. Калибровочные кривые сэндвич-иммуноанализа РЭА: (1) пара СЕА-1/СЕА-10-Су(антитела для иммобилизации СЕА-1) (2) пара СЕА-10/ СЕА-1-Су5 (антитела для иммобилизации СЕА-10).

Подбор условий проведения иммуноанализа Для оптимизации процедуры иммуноанализа было исследовано влияние температуры реакционной смеси. Микрочипы, содержащие иммобилизованные антитела СЕА-1, инкубировали с раствором РЭА (в концентрациях от 0.5 до 40 нг/мл) в течение ч при различных температурах. После отмывки, микрочипы инкубировали в течение двух часов с флуоресцентно мечеными антителами СЕА-10-Су5 при температуре 20°С. В результате были получены зависимости интенсивности флуоресценции гелевых ячеек с иммобилизованными антителами от концентрации РЭА в растворе (калибровочные кривые) для различных температур (рис.7).

Рис.7. Калибровочные кривые сэндвич-иммуноанализа РЭА на микрочипах, полученные о P для различных температур: (1) температура инкубации 37P С; (2) температура инкубации о о P P 23P С; (3) температура инкубации 4P С.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»