WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

1. IgG1 PerCP 2. CD45 PerCP/IgG1FITC 3. CD45 PerCP/HEA 125 FITC/IgG1 PE 4. CD45 PerCP/HEA 125 FITC/CD95 PE 5. CD45 PerCP/HEA 125 FITC/HLA-DR PE При анализе субпопуляционного состава опухолевых клеток также накапливали CD45-негативные события, далее выбирали гейт опухолевых клеток (R2 на рисунке 1Б), и в этом гейте оценивали процентное содержание HLA-DR+ и CD95+ клеток. Следует сказать, что при оценке популяций важно набрать как можно больше событий в области опухолевых клеток, что возможно только при условии очень высокой клеточности образца или выраженном метастатическом процессе.

Цитоморфологическое и иммунологическое исследование костного мозга.

Клетки костного мозга получали при пункции, которую осуществляли в области грудины (стернальная пункция). Объем костномозгового пунктата обычно составлял от 0,3 до 0,7 мл (при большем объеме возможно разбавление образца периферической кровью).

Цитоморфологическое исследование.

Из аспирата костного мозга сразу после взятия готовили мазки обычным способом, проводили их окраску по Романовскому-Гимзе и подсчет миелограммы.

Иммуноцитологическое исследование.

Из выделенных клеток костного мозга готовили цитоцентрифужные препараты (1 миллион клеток на лунку). Для выявления опухолевых клеток использовали МКА KL-1 к панцитокератинам, любезно предоставленные J.

Brochier (Франция).

Подсчет опухолевых клеток проводили на 1 млн миелокариоцитов костного мозга дважды у каждого больного. Учитывали как единичные антиген-позитивные клетки, так и комплексы антиген-позитивных клеток.

Статистическая обработка полученных данных.

Выживаемость больных (время до прогрессирования и общая выживаемость) анализировали в соответствие с методом Каплана-Мейера и сравнивали по лог-ранг тесту.

Для сравнения качественных признаков использовался 2-тест с поправкой Ейтца на непрерывность при таблицах сопряжения 2х2 или точный критерий Фишера при малых выборках. Во всех случаях применялся 95% доверительный интервал и двусторонний Р.

Результаты.

Выявление микрометастазов рака молочной железы в периферической крови методом проточной цитофлуориметрии.

С целью обнаружения циркулирующих опухолевых клеток у больных выполнено 85 иммунологических исследований периферической крови.

Выявление и определение количества опухолевых клеток в периферической крови проводили методом проточной цитометрии c использованием моноклональных антител к мембранным панэпителиальным антигенам Egp34 и BerEP4.

Поскольку единства мнений о значении количества опухолевых клеток, циркулирующих в периферической крови больных на разных этапах системного лечения, и связи этого показателя с известными морфологическими, клиническими и прогностическими характеристиками рака молочной железы в современной литературе нет, мы посчитали целесообразным провести детальный количественный анализ полученных данных.

Была сопоставлена различная чувствительность метода иммуноцитофлуориметрического выявления ЦОК: 1 клетка на 1 млн лейкоцитов и 1 клетка на 100 000 лейкоцитов. При анализе с точностью клетка на миллион лейкоцитов частота выявления ЦОК составила 47,6%, а при анализе с точностью 1 клетка на 100 000 лейкоцитов частота выявления ЦОК составила 41,3%.

Для повышения точности исследования и исключения единичных случайных событий, количество антиген-позитивных клеток 10 на миллион лейкоцитов было решено принимать за негативный результат, т.е. в группу позитивных больных относили только пациентов с заведомо позитивным результатом исследования (более 10 ЦОК на 1 миллион лейкоцитов).

Частота выявления ЦОК у больных местно-распространенным и диссеминированным РМЖ составила до лечения 41,3%.

У больных местно-распространенным раком молочной железы и у больных с отдаленными метастазами циркулирующие опухолевые клетки методом проточной цитометрии выявляются приблизительно с одинаковой частотой: у 3 из 7 (42,9%) и 21 из 56 больных (41%) соответственно.

В таблице 1 показано распределение больных в зависимости от количества ЦОК, выявленных с помощью моноклональных антител к панэпителиальным антигенам.

Таблица 1.

Количественная характеристика ЦОК в периферической крови больных местно-распространенным и диссеминированным РМЖ до начала системного лечения.

Анализируемые группы (кол-во ЦОК/млн Частота случаев лейкоцитов крови Количество Процент 1 группа (0 – 10 клеток) 37 58,7% 2 группа (11 – 100 клеток) 18 28,6% 3 группа (> 100 клеток) 8 12,7% Как видно из таблицы, ЦОК в большинстве случаев (69,2%) обнаружены в умеренном количестве (от 11 до 100 на миллион лейкоцитов), лишь у 30,8% больных (8 из 26) выявлено более 100 ЦОК на миллион лейкоцитов.

Наиболее часто ЦОК обнаруживали у больных с метастазами только во внутренние органы: у 14 из 27 больных (51,9%). У этих больных высокое содержание ЦОК (более 100 на миллион лейкоцитов) отмечено чаще всего 15% случаев (таблица 2). В группе больных с метастазами только в кости и с метастазами и в кости, и во внутренние органы ЦОК выявлены с одинаковой частотой – 31,3% (у 5 из 16 больных) и 30,8% (у 4 из 13 больных) соответственно. Взаимосвязи между признаками (наличие ЦОК и локализация метастазов) не установлено (Р = 0,25).

Таблица 2.

Частота выявления ЦОК в периферической крови больных раком молочной железы с различной локализацией метастазов.

Метастазы только в Метастазы в кости и Метастазы только во кости внутренние органы внутренние органы Признак (n = 16) (n = 14) (n = 27) Наличие ЦОК 5/16 (31,3%)* 4/14 (30,8%) 14/27 (51,9%) 100 ЦОК 2/16 (12,5%) 1/14 (7,7%) 4/27 (14,8%) * количество (процент) Взаимосвязь между наличием ЦОК, морфологическими и прогностическими характеристиками рака молочной железы.

ЦОК выявлены чаще у больных с наличием одного или двух рецепторов стероидных гормонов в ткани опухоли (n = 24), чем у больных с отрицательным рецепторным статусом (n = 18) – 45,8% и 22,2% соответственно. Однако взаимосвязь между признаками не была статистически значимой (р = 0,11).

У больных в менопаузе ЦОК выявлены в периферической крови чаще - 47,82%, чем у больных с сохраненной менструальной функцией (n = 15) - 26,7%. Взаимосвязь между признаками (2 ) статистически значима (р=0,045).

При инфильтративном дольковом РМЖ ЦОК в периферической крови обнаружено чаще, чем у больных протоковым инфильтративным РМЖ (69,2% и 31% соответственно). Взаимосвязь между признаками (2) статистически значима (р = 0,02).

Динамика ЦОК у больных РМЖ в процессе лечения.

Иммуноцитофлуорометрическое исследование периферической крови в динамике было проведено 19 больным.

Частота выявления ЦОК после лечения составила 45,5%.

Таким образом, у большей части больных после проведения системного противоопухолевого лечения в периферической крови продолжали циркулировать опухолевые клетки.

Противоопухолевый эффект терапии был оценен у 17 пациенток. У больных (71%) динамика количества опухолевых клеток (до и после лечения) совпадала с клинической и рентгенологической оценкой состояния болезни:

т.е. при прогрессировании заболевания количество опухолевых клеток в периферической крови возрастало, а при стабилизации заболевания или частичной регрессии количество опухолевых клеток снижалось по сравнению с начальным уровнем.

В таблице 3 представлено количество ЦОК у больных раком молочной железы до и после лечения и эффект лечения.

Таблица 3.

Количество ЦОК в динамике у больных раком молочной железы до и после лечения и оценка лечебного эффекта по клиническим данным и данным объективных методов обследования Кол-во Кол-во Динамика Эффект лечения по N ЦОК ЦОК ЦОК клиническим и до после рентгенологическим данным лечения лечения 1.

10 2 = СЗ 2.

3 104* ПР 3.

0 25 СЗ 4.

11 0 Неизвестен 5.

37 500 СЗ 6.

20 2 СЗ 7.

56 7 СЗ 8.

7 4 = ПР 9.

0 48 ПЗ 10.

0 0 = ЧР 11.

418 204 СЗ 12.

21 10 ЧР 13.

234 50 СЗ 14.

167 0 ЧР 15.

7 27 ЧР 16.

3 17 Неизвестен 17.

0 5 = СЗ 18.

0 8 = СЗ 19.

0 22 ЧР **409 ПЗ - снижение количества ЦОК, - повышение количества ЦОК, = - количество ЦОК не изменилось (изменения в пределах 0-10 клеток считали «=») * - исследование выполнено через 1,5 месяца после неоадъювантной химиотерапии, оперативного удаления опухоли молочной железы и лучевой терапии ** - повторное исследование при прогрессировании РМЖ Влияние циркулирующих опухолевых клеток на прогноз больных местно-распространенным и диссеминированным РМЖ Для того чтобы оценить, влияет ли наличие до лечения циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови больных распространенным раком молочной железы на прогноз, были изучены время до прогрессирования и общая продолжительность жизни во всей анализируемой группе и в подгруппах больных.

Медиана общей продолжительности жизни составила 21,7 месяцев (от 2 до 51 месяцев).

Как известно, продолжительность жизни больных распространенным РМЖ во многом зависит от локализации метастазов (висцеральные или только костные метастазы), а также от количества зон поражения. Были проанализированы отдаленные результаты лечения в подгруппах больных с различной локализацией метастазов. Наличие ЦОК до лечения не оказывало влияния на продолжительность времени до прогрессирования (р=0,7), но влияло на общую продолжительность жизни (р=0,06) только в подгруппе больных с метастатическим поражением костей (с наиболее благоприятным прогнозом в группе больных диссеминированным РМЖ). В этой группе медиана общей продолжительности жизни была почти в 2 раза длиннее у больных с отсутствием ЦОК до начала лечения. Результаты анализа времени до прогрессирования и общей продолжительности жизни в группах больных с различной локализацией метастазов представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Время до прогрессирования и общая продолжительность жизни у больных с разной локализацией метастазов в зависимости от наличия или отсутствия ЦОК до лечения Наличие ЦОК Медиана Р (log-rank Медиана Р (log-rank ВДП, мес. test) ОВ, мес. test) Метастазы 7 + только в кости, Р = 0,7 Р = 0,(n = 14) 8 21,- Метастазы в 6,5 15,+ кости и внутренние Р = 0,34 Р = 0,органы, 5 - (n = 13) Метастазы 8 + только во внутренние Р = 0,26 Р = 0,органы, 7,5 13,- (n = 27) У больных с метастазами во внутренние органы ЦОК в периферической крови до лечения не оказывали влияния на продолжительность интервала без прогрессирования (р=0,26) и общую продолжительность жизни (р=0,1).

При изучении общей продолжительности жизни и времени до прогрессирования в зависимости от наличия циркулирующих опухолевых клеток в крови после системного лечения вся группа больных была поделена на 2 подгруппы: ЦОК-позитивную (более 10 клеток на миллион клеток крови) и ЦОК-негативную. Оказалось, что медиана времени до прогрессирования в ЦОК-негативной (после проведения системного лечения) группе была в 2 раза выше, чем в ЦОК-позитивной группе, однако различия статистически недостоверны (p = 0,31).

У больных из ЦОК-негативной группы отмечены незначительные преимущества в общей продолжительности жизни (различия статистически недостоверны, р = 0,89). Полученные результаты отражены в таблице 5.

Таблица Время до прогрессирования и общая продолжительность жизни больных РМЖ в зависимости от наличия ЦОК в периферической крови после проведения системного лечения Показатель ЦОК-негативная ЦОК-позитивная P (log-rank test) выживаемости группа группа Медиана времени до прогрессирования, 15 7,5 Р=0,мес. (n = 20) (n = 12) (n = 8) Медиана выживаемости, 23,5 17,5 Р=0,мес. (n = 20) (n = 12) (n = 8) Медиана общей продолжительности жизни больных с высоким уровнем ЦОК (более 100 клеток/млн) была меньшей, чем в случаях наличия 10-100 ЦОК (15 и 21 мес. соответственно), однако различия статистически не достоверны.

С целью ответа на вопрос, возможен ли мониторинг эффективности химио/гормонотерапии с помощью количественного анализа ЦОК, были проанализированы результаты лечения больных в зависимости от динамики ЦОК до и после лечения.

Динамика циркулирующих опухолевых клеток оценена у 19 больных, у 16 из них оценены показатели выживаемости. У 31,3% больных (5 из 16) количество ЦОК повысилось после лечения, у 68,7% (11 из 16) - количество ЦОК снизилось или осталось неизменным.

У больных с отсутствием нарастания количества ЦОК после лечения отмечаются преимущества в продолжительности времени до прогрессирования (р = 0,0126, Log-rank test) перед больными, у которых количество ЦОК нарастало или оставалось неизменным (рисунок 2).

Рисунок 2.

Время до прогрессирования у больных РМЖ в зависимости от динамики уровня ЦОК после проведения противоопухолевой терапии (пунктир – отсутствие нарастания ЦОК, сплошная линия – увеличение количества ЦОК).

Безрецидивная выживаемость 1,1,1,,,кумулятивная,вероятность,отсутствия прогрессирования,Динамика ЦОК,,,повышение уровня ЦОК,0,-,-,снижение р = 0,0126 уровня ЦОК 0 10 20 30 40 время до прогрессирования (мес) месяцы На общую продолжительность жизни снижение или повышение количества ЦОК после лечения не влияло.

Иммунологическое обнаружение опухолевых клеток в костном мозге больных РМЖ IIIb, IV стадии Выполнены иммуноцитологические исследования пунктатов костного мозга у 42 больных раком молочной железы. Костный мозг исследовали иммуноцитологическим методом флуоресцентной микроскопии с помощью моноклональных антител к панцитокератинам KL-1. Одновременно в полученных мазках костного мозга производили подсчет миелограммы.

Процент выживших В группе больных метастатическим раком молочной железы иммунологическое исследование костного мозга до начала лечения проведено 36 больным. KL-1-позитивные клетки у этих пациентов были обнаружены у 21 больной (58,7%). Их количество варьировало от 1 до 464 на 1 миллион миелокариоцитов: от 1 до 10 опухолевых клетки выявлено у 16, от 11 до 100 клеток – у 4, более 100 клеток – у 2 больных. При стандартном цитологическом исследовании метастазы в костный мозг были выявлены у больных диссеминированным раком молочной железы (13,9%).

В группе больных местно-распространенным раком молочной железы иммунологическое исследование костного мозга до начала лечения проведено 6 больным, KL-1-позитивные клетки обнаружены у 2 больных (33,3%). В одном случае было обнаружено 12 опухолевых клеток на миллион клеток костного мозга, в другом случае – 1 клетка. При цитологическом исследовании метастазов в костный мозг у этих больных не выявлено.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»