WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

1.3. Анализ экспрессии генов в опухолях печени человека Исследование химически индуцированных ГК мышей, несомненно, представляет научный интерес, однако оставалось неясным, насколько справедливы закономерности, полученные на экспериментальных моделях, в которых опухоли развиваются не в естественном микроокружении печени, а растут подкожно, а также, распространяются ли полученные результаты на ГК человека. Для решения этой задачи мы провели анализ экспрессии тех генов, экспрессия которых менялась в ГК мышей по сравнению с нормальной печенью, в панели из различных опухолей печени человека. Для этого в сотрудничестве с отделением опухолей печени и поджелудочной железы НИИ Клинической онкологии РОНЦ РАМН (руководитель – проф. Ю.И. Патютко) была собрана панель из 21 ГК (4 из них были ассоциированы с инфекцией вирусами гепатита B, «HBV+»), 1 гепатобластомы, и 3 холангиокарцином (ХЦР) (2 из них были ассоциированы с инфекцией вирусом гепатита В), полученных в результате резекции опухолей у пациентов РОНЦ РАМН. В качестве контроля к каждой опухоли использовали образцы неопухолевой ткани печени, изъятой в ходе операции у того же пациента. Кроме того, общим контролем специфичности праймеров служили нормальная печень взрослой мыши и клетки высокодифференцированной человеческой гепатокарциномы HepG2.

Методом ОТ-ПЦР был проанализирован спектр экспрессии 32 генов. Оказалось, что наиболее значимым нарушением транскрипционной программы гепатоцитов было подавление экспрессии HNF4 (Рис. 5). Мы показали, что экспрессия гена HNFполностью утрачена в 7 и понижена в 5 из 17 ГК (71%), не ассоциированных с инфекцией вирусами гепатита (Рис. 5). Примечательно, что ни в одной из ГК, возникших у пациентов, инфицированных HBV, снижения уровня транскрипции HNF4 не наблюдалось. Возможно, прогрессия таких опухолей протекает по HNF4-независимому пути, либо связана с инактивацией продукта этого гена на белковом уровне.

Рисунок 5. Экспрессия некоторых генов в ГК человека невирусного происхождения..

Фотография электрофореза продуктов ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к указанным генам. Продукты ОТ-ПЦР мРНК ГК человека (дорожки 1,3,7,9,11), неопухолевой ткани печени тех же пациентов (дорожки 2,4,6,8,10), клеток культуры HepG2 (дорожка 13), нормальной печени взрослой мыши (дорожка 14). ОТ-ПЦР с праймерами к гену глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH) служит контролем равенства количества мРНК, взятого в реакции.

Кроме того, в опухолях печени человека также, как в мышиных ГК, была показана корреляция между уровнем транскрипции HNF41 и степенью дифференцировки:

большая часть из высокодифференцированных опухолей (10 из 13) экспрессирует HNF41. При этом, вклад в суммарное количество HNF4 вносила как взрослая форма HNF41, так и эмбриональная сплайс-форма HNF47. Кроме того, изоформа HNFбыла гиперэкспрессирована во всех образцах ткани, прилежащей к ГК (как в случае «HNF4+», так и для «HNF4-» опухолей). Тот факт, что в неопухолевой ткани транскрибируется ген, активность которого характерна для эмбрионального этапа развития, может свидетельствовать о том, что опухоль способна оказывать влияние на транскрипционную программу окружающих ее клеток. Возможно, это происходит за счет секреции клетками опухоли в окружающее пространство факторов роста, способных индуцировать эмбрио-специфические сигнальные пути, либо металлопротеиназ. Кроме того, в ответ на некроз и фиброз, ассоциированные с развитием опухоли, нормальные гепатоциты, окружающие карциному, вынуждены постоянно пролиферировать (способность к регенерации – свойство, хорошо описанное для клеток печени); не исключено, что такая пролиферативная активность приводит к частичной реверсии дифференцировки, в результате которой во взрослых клетках инициируется экспрессия генов, характерных для незрелых гепатоцитов. Мы полагаем, что экспрессия эмбрионального варианта HNF47, так же, как и снижение транскрипционной активности взрослых изоформ HNF41, являются важными маркерами гепатоканцерогенеза, а последующее исчезновение активности гена HNF47 – маркером поздних стадий опухолевой прогрессии.

Мы также проанализировали спектры экспрессии других печень-специфических генов, изменения в уровней которых были выявлены при анализе панели ГК мыши.

Результаты этой части исследования обобщены в Таблице 1. В частности, было показано, что экспрессия фактора HNF1 была подавлена полностью (4 ГК) или частично (4 ГК) в ГК невирусного происхождения. Как и следовало ожидать, экспрессия гена HNF1 в ГК, ассоциированных с инфекциями вирусами гепатита, практически не отличалась от таковой в норме, что согласуется с экспрессией в этих образцах гена HNF4.

Одновременно с падением HNF1, в 12 невирусных ГК регистрировалась гиперэкспрессия эмбрионального гена HNF1, который в норме не экспрессируется во взрослой печени [Coffinier et al, 1999]. Примечательно, что, как и в случае с экспрессией HNF47, во всех образцах ткани, окружающей гепатокарциномы (за исключением одного случая с ГК вирусной этиологии), наблюдалась гиперэкспрессия этого гена.

Во время резекции опухолей человека, а также при дальнейшем мониторинге пациентов проводился тщательный поиск возможных очагов метастазирования. Таким образом, мы получали доказательства инвазивной способности клеток, входящих в состав изучаемых нами опухолей. Именно поэтому чрезвычайный интерес для нас имели данные об экспрессии группы генов, ассоциированных с ЭМП (Таблица 1). Экспрессия гена Екадхерина была снижена лишь в 2 ГК (1 HBV- и 1 HBV+); примечательно, что ни у одного из пациентов, чьи опухоли вошли в эту группу, не было выявлено очагов метастазирования. Это позволяет предположить, что утрата Е-кадхерина является важным, но не достаточным фактором для похождения ЭМП и приобретения клетками инвазивных свойств. При этом репрессор Е-кадхерина – ген Snail экспрессировался практически во всех (за исключением одной) образцах и опухолей, и неопухолевой ткани (95%). Не исключено, что активация гена Snail значительно предшествует этапу подавления активности гена Е-кадхерина и утраты клетками адгезионных контактов.

Активация еще одного гена, попавшего в эту группу – виментина - является важным условием перехода от цитокератиновых филаментов, характерных для статичного состояния клеток, к виментиновым, ассоциированным с клеточным движением.

Гиперэкспрессия виментина наблюдалась в 13 ГК невирусного происхождения и в 3 ГК, ассоциированных с инфекцией вирусами гепатита (76%). Так же, как в случае Snail, HNF47, HNF1 и других генов, экспрессия виментина была зарегистрирована не только в опухолях, но и в неопухолевой ткани печени (14 образцов от пациентов с ГК невирусного происхождения и 2 - от пациентов с ГК, больных гепатитом). Как и в случае Snail, логично предположить, что активация виментина происходит в ответ на внешний сигнал, который, возможно, генерируется клетками опухоли.

Кроме того, мы подтвердили, что прогрессия гепатокарцином сопровождается индукцией TGF-респонсивных генов: было показано, что фоновая активность гена TGF1 наблюдается практически во всех образцах ГК и окружающей их неопухолевой ткани (экспрессии не было зарегистрировано в одной паре опухоль-печень из HBV+ ГК, а также в 3 образцах опухолей и одной печени из группы HBV- ГК). В то же время, хотя фоновый уровень экспрессии TGF2 регистрировался в 16 из 21 (76%) образцов неопухолевой ткани, в опухолевых образцах наблюдалось значительное повышение этого уровня (10 из 21 пар опухоль-окружающая ткань) (Таблица 1, Рис. 5).

Мы проанализировали спектры экспрессии генов, потенциально вовлеченных в гепатоканцерогенез (кавеолина, SLPI, аннексина, цитохезина, ASNS, Ras и Ufo/Axl), в опухолях печени человека (Табл. 1). Примечательно, что в неопухолевой ткани вновь наблюдалась активация генов, подавленных в нормальной печени. Так, экспрессия SLPI была зарегистрирована в 17 из 21 образцов печени, гиперэкспрессия ASNS – в 8 (однако в 7 парах ГК-печень активация гена наблюдалась лишь в опухолях), кавеолина – в пробах ткани, окружающей опухоль, аннексина – в 18 образцах. Таким образом, ни один из генов, попавших в последнюю группу, не характеризовался полным падением или, напротив, абсолютной гиперэкспрессией в опухолях по сравнению с образцами окружающей печени. Нам представляется чрезвычайно важным то наблюдение, что гены, в норме подавленные в здоровой печени, транскрибируются в гепатоцитах в ответ на появление соседствующих опухолевых клеток.

Таблица 1. Изменение экспрессии генов в опухолях печени человека Общее количество: I ГК (HBV-/HBV+), II ХЦР (HBV-/HBV+), III гепатобластом;

IV: Общее количество опухолей с измененной экспрессией гена относительно образца печени того же пациента; V: Количество ГК (HBV-) с измененной экспрессией гена относительно образца печени того же пациента; VI: Количество ГК (HBV+) с измененной экспрессией гена относительно образца печени того же пациента; VII: Количество ХЦР (HBV-) с измененной экспрессией гена относительно образца печени того же пациента;

VIII: Количество ХЦР (HBV+) с измененной экспрессией гена относительно образца печени того же пациента; IX: Экспрессия гена в гепатобластоме относительно образца печени того же пациента. Стрелками обозначено повышение или подавление активности гена в опухоли по сравнению с образцом неопухолевой ткани печени того же пациента.

Изучение регуляторного района гена HNFМетодом ОТ-ПЦР мы проанализировали спектр экспрессии генов в 11 ГК мыши и человеческих опухолях печеночного происхождения. Из 46 генов, включенных в исследование, наиболее значимая корреляция экспрессии с уровнем дифференцировки и обратная зависимость со скоростью роста in vivo была выявлена для гена HNF41 и его транскрипционных мишеней. Совместно с данными других исследований [Lazarevich et al., 2004, Chiba et al. 2005, Hwang-Verslues et al. 2007, Spath и Weiss, 1998], полученные нами результаты позволяют предположить, что фактор HNF41 играет ключевую роль в поддержании дифференцированного фенотипа печени, а подавление активности этого гена является важным этапом опухолевой прогрессии. Таким образом, изучение регуляции гена HNF41 и выяснение причины его репрессии в клетках дедифференцированных гепатом представляется важным этапом изучения прогрессии опухолей печени.

В представленной работе мы выяснили, какой участок регуляторного района гена HNF41 определяет снижение уровня его экспрессии в ходе опухолевой прогрессии. Для этого мы провели серию трансфекций с набором генетических конструкций, в которых репортерный ген находился под контролем различных фрагментов регуляторного района HNF41. Репортерные плазмиды были сконструированы на основе вектора pZLuc и содержали ген люциферазы светлячка, лишенный собственного промотора и контролируемый фрагментами 5’ регуляторного района HNF41. Фрагменты получали при удалении участков разной длины с 5’ конца регуляторного района HNF41, дистального от точки начала транскрипции, до +182 п.н. В работе использовали следующие конструкции:

- «-7.5» (-7.5 т.п.н./-5.3 т.п.н. и -1.4 т.п.н./+182 п.н.), - «-6.8» (-6.8 т.п.н./+182 п.н.), - «-1.4» (-1.4 т.п.н./+182 п.н.), - «-363» (-363 п.н./+182 п.н.), - «-228» (-228 п.н./+182 п.н.), - «-34» (-34 п.н./+182 п.н.), - «0» (плазмида без энхансер-промоторных элементов).

Для контроля эффективности трансфекции и для выравнивания полученных результатов клетки культуры Н33 котрансфицировали отдельно каждой из репортерных конструкций совместно с вектором, кодирующим ген люциферазы Renilla reniformis. С помощью системы двойной люциферазной детекции мы последовательно определяли активность обоих люциферазных генов: гена, находящегося под контролем участка регуляторного района HNF41, а также гена люциферазы Renilla reniformis, по люциферазной активности которого производили выравнивание остальных результатов измерений. Результаты оценки люциферазной активности представлены на Рисунке 6А.

Рисунок 6. Изучение регуляторного района гена HNF Мы наблюдали полную репрессию гена-репортера при трансфекции векторами, в которых экспрессию гена люциферазы контролировал участок регуляторного района –6.т.п.н./+182 п.н. (фрагмент «6.8»), и -1.4.

Оказалось, что под контролем участка «–363» п.н. репортерный ген активен, причем его активность повышается в 20 раз по сравнению с фоновым уровнем. При удалении фрагмента –363 п.н./-228 п.н. активность репортерного гена немного снижалась. Тот факт, что в тех же клетках, что были использованы при трансфекции конструктов «-6.8» и «1.4», возможна активация репортерного гена, свидетельствует о существовании в клетках дедифференцированной гепатомы Н33 репрессора транскрипции, сайт связывания которого локализован на участке –1.4 т.п.н./-363 п.н.

Для того чтобы подтвердить, что подавление активности гена-репортера является результатом репрессии регуляторного района HNF41, специфической для клеток культуры Н33, мы провели серию трансфекций тех же конструктов в клетки дифференцированной гепатомы человека HepG2. В этой культуре описана экспрессия HNF41, таким образом, регуляторный район гена в этих клетках не подавлен каким-либо внутренним транскрипционным репрессором и его активность может служить контролем специфичности работы разных репортерных конструкций.

Полученные нами данные согласуются с результатами исследования независимой лаборатории, что подтверждает их достоверность [Zhong et al, 1994]. Результаты количественной оценки активности репортерного гена люциферазы представлены на Рисунке 6Б.

Как и ожидалось, репортерные конструкции демонстрируют значительную активность в клетках HepG2. В соответствии с литературными данными, репортерный ген люциферазы активируется регуляторным районом HNF41 всеми использованными участками регуляторного района HNF41.

Тот факт, что, в отличие от результатов, полученных для клеток культуры Н33, и «1.4» и «-6.8» фрагменты способны инициировать экспрессию гена-репортера в клетках HepG2, подтверждает предположение о существовании репрессора, способного связываться с участком –1.4 т.п.н./-363 п.н..

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»