WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

врастают ли в опухоль тяжи соединительной ткани; сохраняют ли опухолевые клетки эпителиальный фенотип; одинаковы ли клетки между собой по размеру и плоидности, или же наблюдается выраженный клеточный полиморфизм, также оценивались и внутриклеточные параметры: размеры ядер, их количества, а также консистенция ядер и цитоплазмы.

По результатам гистологического анализа для дальнейших исследований нами было выбрано 11 ГК, из них 5 опухолей были охарактеризованы как высокодифференцированные и 6 образцов получили статус низкодифференцированных ГК.

Примечательно, что опухоли обладали разной скоростью роста (скорость роста опухоли определяли по требуемой частоте перевивки от одной особи к другой).

Оказалось, что ГК, гистологически описанные как высокодифференцированные, росли гораздо медленнее, чем низкодифференцированные опухоли: средняя скорость роста дифференцированной опухоли составляла 3-7 месяцев, а скорость роста низкодифференцированных ГК варьировала от двух недель до двух месяцев. Типичная морфология высоко- и низко-дифференцированной опухоли представлена на рисунке 1.

Рисунок 1. Гистология гепатокарцином мыши.

Левая колонка: высокодифференцированная опухоль (образец № 2); Правая колонка:

низкодифференцированная ГК (образец № 7). Окраска гематоксилином и эозином.

Увеличение 1*400 (А, В) и 1*1000 (Б, Г). Высокодифференцированная опухоль сохраняет характерную для печени балочную структуру, клетки одинаковы по размеру. Клетки низкодифференцированной опухоли различаются по размеру и плоидности, часто встречаются митозы, заметны врастания тяжей соединительной ткани.

1.2. Анализ экспрессии генов в ГК мыши Следующим этапом работы стало проведение анализа спектра генов, экспрессируемых в панели мышиных ГК. Для этого из образцов опухолей была выделена суммарная РНК, панель соответствующих РНК была подвергнута обратной транскрипции (ОТ-реакция) с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Для постановки ПЦР использовали специфические праймеры к кДНК исследуемых генов. Полученные данные подтверждали повторными ПЦР с независимо ревертированных кДНК.

В качестве контроля нормального уровня экспрессии генов в панели использовали РНК из нормальной печени взрослой мыши линии BDF. В реакцию обратной транскрипции брали равное количество РНК из каждого образца, однако для полного подтверждения точности выравнивания проводили ПЦР с праймерами к гену гипоксантин фосфорибозилтрансферазы (HPRT), который равномерно экспрессируется во всех клетках. Результаты ОТ-ПЦР исследований представлены на Рисунках 2-4. На электрофорез продукты ПЦР наносили в следующем порядке: образец №1 – нормальная печень взрослой мыши, образцы № 2-6 – высокодифференцированные ГК (где №соответствует мГК), образцы № 7-12 – низкодифференцированные ГК (где №соответствует бГК).

В первую очередь нами был проведен анализ спектров экспрессии печеньспецифических генов: альбумина, онко-эмбрионального маркера альфа-фетопротеина (АФП) и различных ГЯФ (Рис. 1). По итогам проведенного исследования часть последовательностей были описаны нами как гены, экспрессия которых полностью коррелирует с уровнем дифференцировки опухоли. Остальные гены были активны как в высоко-, так и в низкодифференцированных ГК мышей.

Тот факт, что экспрессия альбумина – основного маркера зрелых гепатоцитов – наблюдалась лишь в нормальной печени и в тех пяти опухолях, которые при гистологическом анализе были признаны высокодифференцированными, подтверждает четкое соответствие между гистологическим и молекулярными методами оценки уровня дифференцировки образцов.

Один из компонентов центральных регуляторной сети ГЯФ – транскрипционный фактор HNF4 предположительно связывается с респонсивными элементами более, чем 12% генов [Odom et al, 2004], экспрессирующихся в гепатоцитах человека, продукты этих генов вовлечены в самые разнообразные процессы клеточного метаболизма, дифференцировки и роста гепатоцитов [Duncan et al, 1997; Hatzis и Talianidis, 2001; Lucas et al, 2005]. Группой авторов [Spath и Weiss, 1997] было выдвинуто предположение, что HNF4 является морфогеном и способен индуцировать мезенхимально-эпителиальный переход. Ранее на модели одноступенчатой прогрессии гепатокарциномы нами было показано, что вынужденная экспрессия HNF4 приводит к частичной реверсии злокачественного фенотипа [Lazarevich et al, 2004]. В настоящей работе мы показали, что HNF4 экспрессирован во всех высокодифференцированных опухолях на том же уровне, что и в нормальной печени мыши (Рис. 2). При этом экспрессии HNF4 в дедифференцированных образцах не было обнаружено. Это подтверждает ранее выдвинутое предположение [Lazarevich et al, 2004] о взаимосвязи активности гена HNFи уровня дифференцировки клеток, и важной роли репрессии этого фактора при прогрессии ГК.

Рисунок 2. Экспрессия печеньспецифических генов в ГК мышей.

Фотография электрофореза продуктов ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к указанным генам. Продукты ОТ-ПЦР мРНК нормальной печени взрослой мыши (дорожка 1), дифференцированных ГК мыши (дорожки 2-6), низкодифференцированных ГК мыши (7-12).

ОТ-ПЦР с праймерами к гену HPRT служит контролем равенства количеств мРНК, взятых в реакции.

Существует 9 вариантов альтернативного сплайсинга гена HNF4. Все они обладают различными свойствами и функциями. Такое разнообразие обусловлено существованием двух независимых промоторов, контролирующих транскрипцию гена.

Показано, что для взрослых гепатоцитов характерна экспрессия изоформ 1-6 с промотора Р1 (далее «HNF41»), в то время как в эмбриональной печени транскрипция осуществляется преимущественно с Р2 (изоформы 7-9, далее – «HNF47»).

Примечательно, что, в отличие от нормальной печени мыши, в которой выявляется только 1 варианты сплайсинга, в опухолях вклад в суммарное количество HNF4 вносят как 1, так и 7 формы сплайсинга, что указывает на активацию альтернативного промотора гена HNF4 на ранних стадиях прогрессии опухоли.

В группу печень-специфических генов, экспрессия которых четко коррелировала с уровнем HNF4 и выявлялась только в дифференцированных медленнорастущих ГК, попали гены HNF1, HNF1, HNF3, C/EBP и FTF (Рис. 2). Это согласуется с полученными ранее данными об индукции в клетках культуры бГК генов HNF3, HNFи FTF при экзогенной экспрессии HNF41 [Lazarevich et al, 2004].

Транскрипты генов HNF6, HNF3, HNF3 и C/EBP обнаруживались как в высоко-, так и в низкодифференцированных образцах. По всей вероятности, факторы HNF3 и HNF3, являясь одними из самых ранних эффекторов эмбриогенеза печени, во взрослом организме не оказывают определяющего влияния на дифференцировку. Таким образом, несмотря на сохранение экспрессии HNF3 и HNF3, ряд опухолей претерпевает дедифференцировку, и лишь гепатокарциномы, экспрессирующие HNF4, сохраняют основные свойства клеток, из которых они произошли.

Важным этапом прогрессии эпителиальных опухолей является эпителиальномезенхимальный переход (ЭМП) – процесс, выражающийся в утрате клетками эпителиальной морфологии, общей дедифференцировке и приобретении клеточной подвижности. Нам представилось целесообразным выяснить, экспрессия каких из генов, ассоциированных с ЭМП, нарушается при прогрессии ГК мыши (Рис. 3А). Мы наблюдали тенденцию сохранения высокодифференцированными опухолями эпителиальных маркеров и приобретения низкодифференцированными опухолями свойств мезенхимы:

активации генов виментина, Snail, при одновременном падении уровня транскрипции эпителиальных маркеров Е-кадхерина и коннексина 32 (Сх 32). Тем не менее, ни для одного из исследованных генов этой группы не было выявлено полной корреляции экспрессии с уровнем дифференцировки опухолей (Рис. 3А). По всей видимости, изменение активности рассмотренных генов не является абсолютно необходимым условием для прогрессии ГК, а индукция ЭМП может осуществляться разными путями.

В исследованных нами ГК повышается экспрессия генов, продукты которых способны оказывать антиапоптотическое действие bcl2, bcl-xl, при этом четкой корреляции между степенью злокачественности опухоли и паттерном экспрессии этих генов выявлено не было (Рис.3Б). Экспрессия гена рецептора смерти Fas, определяющего чувствительность клеток к проапоптотическим стимулам, регистрируется лишь в части исследованных опухолей (4 высоко- и 1 дедифференцированной ГК), а также в печени нормальной мыши, что указывает на возможность апоптотического контроля в этих образцах. Вполне вероятно, что ГК, в которых произошло подавление транскрипции рецептора смерти, приобрели резистентность к внешним проапоптотическим сигналам.Вероятно, что процессы дедифференцировки и подавления апоптотических программ протекают параллельно и не имеют общего индуктора. Тот факт, что в дифференцированных ГК все еще регистрируется экспрессия гена рецептора смерти Fas, позволяет предположить, что подавление возможности экзогенной индукции апоптоза является важным шагом опухолевой прогрессии.

Рисунок 3. Экспрессия генов, ассоциированных с ЭМП (А) и апоптозом (Б), в ГК мышей. Фотография электрофореза продуктов ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к указанным генам. Продукты ОТ-ПЦР мРНК нормальной печени взрослой мыши (дорожка 1), дифференцированных ГК мыши (дорожки 2-6), низкодифференцированных ГК мыши (7-12). ОТ-ПЦР с праймерами к гену HPRT служит контролем равенства количеств мРНК, взятых в реакции.

Целью нашего исследования был поиск и характеристика новых потенциальных маркеров прогрессии гепатокарцином. По результатам, полученным Н. Лазаревич при анализе профилей транскрипции при бГК и мГК методом гибридизации с микрочипами, в группу интереса попали несколько генов, уровень экспрессии которых значительно изменялся в опухолях по сравнению с нормальной печенью (аспарагинсинтаза ASNS, секреторный лейкоцитарный ингибитор протеаз SLPI, циклин G, остеопонтин), а также некоторые гены, гиперэкспрессированные в бГК по сравнению с мГК (цитохезин, кавеолин, 5’TG3’ взаимодействующий фактор TGIF, TGF-стимулируемый клон 22 TSC22, киназа Ufo/Axl, TGF -индуцируемый белок 68 kDa Tbi-68). Мы выбрали для дальнейшего анализа только те гены, которые потенциально могли оказаться маркерами или эффекторами гепатоканцерогенеза. Таким образом, в группу интереса попали гены транскрипционных факторов, последовательности, кодирующие поверхностные маркеры, а также гены, продукты которых секретируются опухолевыми клетками. По результатам проведенного анализа мы охарактеризовали гены остеопонтина, кавеолина и цитохезина как наиболее перспективные маркеры гепатоканцерогенеза, а гены Ufo/Axl, ASNS – как предположительные маркеры опухолевой прогрессии (Рис. 4). Примечательно, что большинство генов этой группы являются TGF-респонсивными. Белки семейства TGF (трансформирующий фактор роста ) являются регуляторами роста, развития и дифференцировки. Они играют двоякую роль в развитии и канцерогенезе печени [Mikula et al., 2003; Valdes et al, 2002]: показано, что они ингибируют пролиферацию эпителиальных клеток нормальной печени, однако способствуют ускорению роста трансформированных гепатоцитов. Клетки, способные выжить при воздействии TGF, сначала претерпевают ЭМП, а затем приобретают способность аутокринно стимулировать пролиферацию посредством секреции TGF1. В настоящее время у млекопитающих идентифицировано три представителя семейства TGF: 1, 2 и 3, в различных типах клеток печени экспрессируются только TGF1 и 2.

Рисунок 4. Экспрессия генов, нарушение активности которых ассоциировано с гепатоканцерогенезом. Фотография электрофореза продуктов ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к указанным генам. Продукты ОТ-ПЦР мРНК нормальной печени взрослой мыши (дорожка 1), дифференцированных ГК мыши (дорожки 2-6), низкодифференцированных ГК мыши (7-12). ОТ-ПЦР с праймерами к гену HPRT служит контролем равенства количеств мРНК, взятых в реакции.

Анализ уровней экспрессии этих генов показал, что в опухолевых образцах наблюдается гиперэкспрессия факторов TGF1 и TGF2, а также их генов-мишеней (TSC22, Tbi-68, TGIF, остеопонтина, циклина G) причем в низкодифференцированных опухолях регистрируется преимущественно транскрипция фактора TGF2, в то время как TGF1 экспрессирован практически во всех ГК (Рис. 4).

Ранее в нашей лаборатории было показано, что клетки бГК в культуре активно секретируют TGF2, добавление которого в культуральную среду способствует защите различных типов клеток от апоптоза, вызываемого повреждением ДНК. В то же время, TGF1 не оказывает такого воздействия. [Овчинников, 2004]. Вместе эти данные свидетельствуют в пользу предположения о том, что именно TGF2, а не TGF1, играет важную роль в прогрессии гепатокарцином.

Итак, на коллекции химически индуцированных гепатокарцином мыши независимого происхождения с различным уровнем дифференцировки и степенью опухолевой прогрессии нам удалось подтвердить основные закономерности тканеспецифической регуляции генов, выявленные ранее на экспериментальной модели одноступенчатой прогрессии гепатокарцином, и определить наиболее значимые из них.

Полученные данные указывают на существование зависимости между дифференцировочным статусом опухоли, ее эпителиальными характеристиками, скоростью роста и паттерном экспрессии ткане-специфических регуляторов транскрипции. В совокупности с полученными ранее результатами эти данные указывают на важную роль ядерного рецептора HNF4 в поддержании дифференцировочного статуса опухолей печени. Кроме того, полученные данные позволяют охарактеризовать некоторые события как потенциальные маркеры опухолевой прогрессии (появление и последующее исчезновение экспрессии HNF47 и HNF1; индукция TGF-респонсивных генов, экспрессия генов Ufo/Axl и ASNS).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»