WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

ФЛЕЙШМАН ДАРЬЯ ИГОРЕВНА ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ПРОГРЕССИИ ГЕПАТОКАРЦИНОМ 14.00.14 – онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2008 1

Работа выполнена в ГУ Российский Онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Российской академии медицинских наук

Научный консультант:

Доктор биологических наук Н.Л. Лазаревич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Б.П. Копнин Доктор биологических наук, профессор В.Я. Бродский

Ведущая организация:

Институт биологии гена РАН, г. Москва

Защита состоится «» _2008 г. в _ часов на заседании диссертационного ученого совета К. 001.17.01 ГУ РОНЦ им.

Н.Н.Блохина РАМН по адресу 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ им.

Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан «» _2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Барсуков 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Опухолевую прогрессию можно охарактеризовать как процесс последовательных генетических мутаций, в результате которых в популяции трансформированных клеток происходит отбор в пользу все более злокачественных клонов. Последовательность и специфичность генетических изменений варьирует от опухоли к опухоли, тем не менее, можно с уверенностью говорить о существовании общей направленности этих изменений:

опухолевая прогрессия сопровождается снижением уровня дифференцировки, увеличением скорости пролиферации клеток, изменением характера взаимодействий между клетками и приобретением способности к метастазированию. Таким образом, направление опухолевой прогрессии складывается из ряда отдельных процессов, каждый из которых возникает в результате генетических изменений, претерпеваемых клетками опухоли, и способствует дальнейшей малигнизации. Общая направленность и единовременность развития позволяет предположить существование взаимосвязи и взаиморегуляции между этими процессами. Однако последовательность и иерархия изменений, ведущих к опухолевой прогрессии, до сих пор остаются малоизученными.

Определение этапов развития опухоли и их генетическая характеристика являются приоритетным направлением онкологии, а выявление событий, маркирующих опухолевую прогрессию, представляет не только огромный научный интерес, но и позволяет применять новые инструменты для диагностики и терапии опухолей.

Настоящая работа посвящена поиску новых молекулярных маркеров прогрессии гепатоцеллюлярных карцином. Гепатокарциномы (ГК) – опухоли, возникающие из зрелых клеток печени - гепатоцитов, являются наиболее распространенной формой опухолей печени. Прогрессия ГК ассоциирована с изменением набора экспрессируемых генов, кодирующих опухолевые супрессоры, факторы роста, компоненты межклеточных и адгезионных контактов, а также ткане-специфические транскрипционные факторы и, соответственно, их мишени. К настоящему времени идентифицирован ряд генов, функция которых нарушена в большинстве ГК, однако ключевые механизмы, определяющие развитие злокачественного фенотипа ГК, остаются неясными. Исследования последних лет показали, что в ряде случаев дедифференцировка ГК сопровождается подавлением экспрессии гепатоцитарных ядерных факторов (hepatocyte nuclear factors, HNF, ГЯФ) – основных печень-специфических регуляторов транскрипции [Wang et al., 1998; Flodby et al., 1995; Xu et al., 2001; Lazarevich et al, 2004]. Более того, было продемонстрировано, что восстановление функции одного из таких факторов, HNF41, в культурах клеток ГК приводит к частичной реверсии злокачественного фенотипа [Lazarevich et al, 2004]; в клетках дедифференцированной гепатомы крысы Н5 под воздействием экзогенного HNF41 происходило частичное восстановление эпителиальной морфологии и реэкспрессия белка адгезионных контактов Е-кадхерина [Spath и Weiss, 1998].

ГЯФ (семейства HNF1, C/EBP, HNF3, HNF4 и HNF6) являются мощными транскрипционными регуляторами, активность которых необходима для развития и поддержания дифференцированного фенотипа гепатоцитов. Факторы, входящие в эти семейства, образуют сложную регуляторную сеть, изменения в работе которой приводит к нарушениям экспрессии огромного спектра генов-мишеней. Однако последовательность нарушения экспрессии ГЯФ, а также значимость каждого из этих нарушений для развития ГК практически не изучены. Нам представлялось чрезвычайно важным выявить молекулярные изменения, наиболее четко отражающие развитие злокачественного фенотипа ГК, а также определить общие генетические изменения, ведущие к прогрессии этого вида опухолей печени.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является выявление и функциональная характеристика молекулярных маркеров прогрессии гепатокарцином мыши и человека.

Для выполнения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи:

1. Создание и гистологическая характеристика коллекции мышиных гепатокарцином независимого происхождения с различным уровнем дифференцировки, а также коллекции гепатокарцином человека.

2. Анализ экспрессии гепато-специфических генов, а также генов, экспрессия которых значительно изменилась при одноступенчатой прогрессии, в панели химически индуцированных гепатокарцином мыши с различной скоростью роста и уровнем дифференцировки.

3. Изучение закономерностей экспрессии гепато-специфических генов, а также потенциальных маркеров гепатоканцерогенеза, в опухолях печени человека, полученных при резекции гепатокарцином у пациентов РОНЦ РАМН.

4. Поиск возможных механизмов возникновения событий, маркирующих опухолевую прогрессию (исследование механизма инактивации гена HNF41).

Научная новизна и практическая значимость исследования На протяжении длительного времени изучение генетических изменений, лежащих в основе гепатоканцерогенеза, ограничивались исследованиями нетканеспецифических факторов, нарушение в активности которых является общим явлением для опухолей разного типа. Работы, посвященные роли ткане-специфических регуляторов транскрипции в прогрессии отдельных типов эпителиальных опухолей, и, в частности, гепатокарцином, чаще всего затрагивали лишь один или несколько из упомянутых транскрипционных факторов, причем о нарушении работы последних судили по результатам анализа модельных систем in vitro.

В представленной работе были проанализированы спектры экспрессии большинства печень-специфических транскрипционных факторов на панели из ГК мыши независимого происхождения, различающихся по уровню дифференцировки и скорости роста, что позволило определить спектр генов, уровни экспрессии которых наиболее четко связаны с этими признаками. Кроме того, следует отметить, что в большинстве работ, посвященных изучению роли ГЯФ в гепатоканцерогенезе, изучаются общие свойства семейств, в то время как в представленном исследовании мы постарались отдельно рассмотреть роль каждого из представителей и его изоформ. Это позволило впервые описать гиперэкспрессию эмбриональной формы HNF47 в образцах дифференцированных гепатокарцином мыши и человека.

На модели ГК мыши независимого происхождения и разного уровня дифференцировки нам удалось показать четкую зависимость между степенью дедифференцировки ГК и профилем экспрессируемых в них ткане-специфических регуляторов транскрипции HNF4, HNF1, HNF1, HNF3, C/EBP и FTF.

В работе впервые проведен анализ полного спектра экспрессии ГЯФ в образцах опухолей печени человека. Впервые охарактеризованы закономерности экспрессии ряда генов (остеопонтина, кавеолина, аспарагинсинтазы ASNS, секреторного лейкоцитарного ингибитора протеаз SLPI, киназы Ufo/Axl), транскрипция которых повышается в ходе гепатоканцерогенеза, в гепатокарциномах и холангиокарциномах человека.

Кроме того, мы впервые показали, что гепатоциты неопухолевой ткани печени пациентов с гепатокарциномами экспрессируют ряд генов, нехарактерных для взрослой печени (например гены HNF47, HNF1, snail и виментин). Эти данные позволяют предположить о влиянии опухоли на генетическую программу клеток окружающей ткани.

Не исключено, что под этим воздействием опухоли нормальные клетки вырабатывают факторы, способствующие изменению внеклеточного матрикса, что в свою очередь ускоряет инвазию опухоли.

Мы установили, что репрессия гена HNF41 в дедифференцированных ГК происходит на транскрипционном уровне. Исследования регуляторного района гена HNF41 показали, что участок –1.4 т.п.н./-363 п.н. ответственен за связывание репрессора, подавляющего транскрипцию гена. Кроме того, впервые показано, что ни один из других ГЯФ - HNF1 и, HNF6, GATA6, HNF3, и, C/EBP и HNF47 - сайты связывания которых находятся в исследованном регуляторном участке, не способен активировать экспрессию гена, контролируемого промотором HNF41.

Изучение взаимосвязи паттерна экспрессируемых генов с прогрессионным статусом опухоли представляет интерес для фундаментальной науки. Выявление маркеров прогрессии ГК является важным этапом в исследованиях механизмов опухолевой прогрессии и представляет новые инструменты для диагностики и мишени для терапии ГК.

Апробация работы Диссертация апробирована 26 сентября 2007 г на совместной научной конференции лабораторий механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, иммунохимии опухолей, цитогенетики, регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ канцерогенеза РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН. Материалы работы докладывались на международной конференции «Молекулярные механизмы сигнальной трансдукции и рака» Европейской Федерации Биохимических обществ (FEBS) (Спецес, 2007), на девятой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология- наука XXI века» (Пущино, 2005), на съезде Европейской Конференции по раковым исследованиям (ЕССО) (Париж, 2005) и на Конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения-2006» (СанктПетербург, 2006).

Публикации По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 статьи в международных и отечественных журналах, и 11 тезисов международных конференций.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста (12 шрифт, полуторный интервал), содержит 12 рисунков, 6 таблиц. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Список литературы содержит 151 источник, в том числе 5 в отечественных рецензируемых изданиях.

Введение Гепатоканцерогенез – это многостадийный процесс, ассоциированный с изменениями спектра генов, экспрессируемых опухолевыми клетками, по сравнению с нормальными гепатоцитами. Очевидно, что для опухолевой прогрессии наиболее значимыми являются нарушения в экспрессии транскрипционных факторов, подавление или индукция которых приводит к изменениям целого ряда генов-мишеней. Фенотип взрослых гепатоцитов формируется при координированном действии белков ГЯФ – эта группа включает 5 семейств транскрипционных факторов: HNF1, C/EBP, HNF3, HNF4 и HNF6, представители которых участвуют в закладке, дифференцировке и дальнейшем поддержании дифференцированного фенотипа печени. Ранее было опубликовано несколько работ, описывающих нарушение экспрессии отдельных ГЯФ в клетках дедифференцированных гепатокарцином, однако механизм нарушения их экспрессии, а также последовательность событий при прогрессии ГК оставались малоизученными.

Ранее в нашей лаборатории была разработана экспериментальная модель одноступенчатой прогрессии, в которой из медленнорастущей высокодифференцированной гепатокарциномы (мГК) мыши одномоментно выщепился злокачественный быстрорастущий низкодифференцированный вариант (бГК). Было показано, что дедифференцировка мГК сопровождалась подавлением активности большинства ГЯФ, а также снижением уровня экспрессии генов, определяющих поддержание эпителиальной морфологии гепатоцитов. Восстановление экспрессии фактора HNF4 в культуре клеток бГК привело к частичной реверсии злокачественного фенотипа. Было выдвинуто предположение, что скоординированная работа ГЯФ играет ключевую роль в поддержании дифференцировки гепатоцитов, причем HNF4 является центральным регулятором этого процесса. Однако механизм подавления HNF4 в бГК оставался неясным.

Для дальнейшего поиска генов, вовлеченных в прогрессию ГК на этой модели, спектры экспрессии генов в мГК и бГК были исследованы с помощью гибридизации с кДНК микрочипами. Было выявлено более 20 потенциальных опухолевых маркеров, экспрессия которых была более чем в 5 раз повышена обеих опухолях по сравнению с нормальной печенью, и около 30 генов со значительным уровнем гиперэкспрессии в бГК по сравнению с мГК – потенциальных маркеров опухолевой прогрессии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Сравнительная характеристика 11 ГК мыши независимого происхождения и разного уровня дифференцировки Для создания адекватной системы для проверки закономерностей экспрессии генов, полученных на модели одноступенчатой прогрессии, нами была проведена сравнительная гистохимическая характеристика ГК мыши независимого происхождения с разной скоростью роста и уровнем дифференцировки. Опухоли были отобраны из полученной ранее в НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН коллекции перевиваемых мышиных ГК. Первичные опухоли были индуцированы у гибридов F1 линий С57В1 и DBA (BDF) диэтилнитрозамином с последующей промоцией фенобарбиталом;

полученные опухоли перевивали подкожно. Для исследования было выбрано 11 опухолей, каждая из которых была охарактеризована гистологически. Для всех 11 ГК методом ОТПЦР нами были проанализированы спектры экспрессии 46 генов, изменения уровней транскрипции которых наблюдались при исследовании модели одноступенчатой прогрессии.

1.1 Гистологический анализ На первом этапе работы был проведен гистологический анализ образцов. Были получены гистологические препараты каждой опухоли. Описание гистологических препаратов проводили в сотрудничестве с В.С. Турусовым и О.В. Морозовой (Лаборатория канцерогенных веществ НИИ канцерогенеза РОНЦ РАМН). Степень дифференцировки опухоли определялась следующими факторами: сохранилась ли в опухоли хотя бы частично балочная структура печени; каков пролиферативный статус опухоли (оценивали общее количество митозов, а также наличие аномальных митозов);

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»