WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Для выявления свободной RTA в клетках использовали метод непрямой иммунофлуоресценции. При использовании прямой иммунофлуоресценции соотношение сигнал/шум оказалось очень низким. Кроме того, было обнаружено неспецифическое взаимодействие конъюгатов с митохондриями. Были выявлены отдельные скопления, содержащие свободную RTA (См. Рисунок 2). Детектируемые объекты распределены по всей ОП цитоплазме и имеют линейные размеры не менее 0,5 мкм, что свидетельствует о том, что это агрегаты из нескольких молекул, либо единичные молекулы RTA.

Рисунок 2. Детекция RTA внутри клетки.

Распределение 1RAK6-AMI-Alexa 546 в клетках глиомы С6. A – изображение клетки в проходящем свете; Б – флуоресцентный сигнал от конъюгатов 1RAK6-AMI-Alexa 546, изображение получено путем совмещения всех оптических слоев («allmax»); В – наложение А и Б. Линейка – 10 мкм.

0 4 8 12 16 20 время инкубации с рицином, ч Рисунок 3. Накопление свободной RTA в клетках глиомы СУвеличение количества детектируемых объектов во времени. Каждая временная точка – усреднённые значения от подсчета 50 клеток. Динамика накопления RTA на других клеточных линиях была аналогичной, и различалась только абсолютными значениями.

количество детектируемых объектов Изменение количества RTA в клетке, происходящее во времени, оценивали по количеству детектируемых флуоресцентных объектов. Для этого на изображении, полученном при регистрации флуоресценции от флуорохрома, выделяли объекты, размеры которых превосходили 20 пикселей. После этого подсчитывали количество подобных объектов на 1 клетку. Свободная RTA не детектируется в клетках через час после внесения рицина в среду культивирования. После 2 часов инкубации RTA выявлялась на клетках линий 3T3 и C6. Через 4 часа количество детектируемой свободной RTA возрастает и достигает максимальных значений через 16 часов (См. Рисунок 3).

Использование в ТИФА тест-системы 1RAK4/1RAK6-bi позволило выявить Асубъединицы рицина в клеточных лизатах после введения цельного токсина в среду инкубации. Расчёт показал, что на одну клетку приходится от 300 до 450 молекул RTA. Это значит, что детектируемые микроскопическими методами объекты представляют собой единичные молекулы или скопления из 2-3 молекул.

Объём, занимаемый рицином внутри клетки.

Для того, чтобы определить общий объём компартмента, в котором детектируется рицин, было получено 30 наборов оптических срезов с разрешением, при котором реальные размеры пикселя составляют 60 нм. Расстояние между двумя соседними оптическими слоями составило 100 нм. Реальное оптическое разрешение больше данных величин, но такое «избыточное» разрешение необходимо для корректной обработки изображений.

Необработанные данные имели реальное разрешение около 220 нм, однако апертура использованного объектива – 1,4 после математической обработки (деконволюции [Wallace et al., 2001]) позволяет получить виртуальное разрешение 140 нм. После уточнения размеров везикул с помощью деконволюции в программе AutoQuant 9.3. был проанализирован общий объём флуоресцирующих объектов. Для этого обработанные изображения анализировали с использованием программного обеспечения Imaris 5.1. Средний анализируемый объём составляет 540±120 мкм3 до обработки и 215±40 мкм3 после.

Ранее показано, что рицин равномерно распределён практически во всём объёме ранних эндосом, положительных по Rab4-ГТФазе [Moisenovich et al., 2004]. Т.о. объём компартмента, содержащего токсин составляет не более 215 мкм3.

1.1.1.1.0.0.0.0.0 4 8 время инкубации с рицином, ч Рисунок 4. Накопление рицина в клетке.

Средние данные по количеству молекул рицина в клетках линии С6.

Использование твердофазного иммуноферментного анализа позволило определить среднее количество белка в клетке. В течение 4 часов количество рицина в клетке достигает 17000 молекул и остаётся на этом уровне длительное время (См. Рисунок 4).

Показано, что средняя концентрация токсина в везикулярном компартменте, содержащем токсин, составляет не менее 1,31*10-7 М после деконволюции и не менее 5,25*10-8 М в случае необработанных данных. Столь высокая концентрация может приводить к образованию агрегатов из молекул токсина и значительному нарушению целостности мембран, что способно инициировать транслокацию A-цепи в цитозоль.

Количество восстановленной RTA составляет 2-3% от количества детектируемого в клетке рицина. Столь малые количества и распределение А-цепи по клетке (отдельные молекулы или кластеры, содержащие несколько молекул), а также отсутствие чувствительных методов детекции, вероятно, и являются причиной того, что раньше обнаружить свободную цепь внутри клетки не удавалось.

Распределенеие свободной RTA в клетке Детекция свободной А-субъединицы в различных клеточных компартментах может свидетельствовать о возможности транслокации RTA из этих компартментов. Ранее показано, что большая часть рицина накапливается в ранне-эндосомальном компартменте [Moisenovich et al., 2004].

клетку, х10 молекул количество молекул рицина на Анализ взаимного распределения свободной A-субъединицы рицина и цельного токсина проводили на клетках линий 3T3 и C6. Для этого клетки обрабатывали токсином, конъюгированным с флуоресцентным красителем FITC, после чего выявляли свободную RTA и определяли уровень совместного распределения (колокализации).

Рисунок 5. Отсутствие колокализации R60-FITC и RTA.

Совместное распределение R60-FITC (зелёные кластеры) и 1RAK6-AMIAlexa 546 (красные объекты) на клетках глиомы С6 через 4 часа инкубации с токсином. Перед фиксацией клетки отмыли раствором лактозы для того, чтобы убрать несвязавшийся рицин. Правый рисунок – оптический срез клетки, левый – диаграмма колокализации.

После 4 часовой инкубации с конъюгатом R60-FITC видно, что сигналы от рицина и его А-цепи находятся в непосредственной близости, но в большинстве своем легко различимы. Представлено изображение одной из 50 обработанных клеток (См. Рисунок 5). В левой части рисунка представлена диаграмма, отражающая распределение пикселей обоих цветов. По оси абсцисс отложена интенсивность флуоресценции канала, детектирующего сигнал от RTA (Ch3-T1), а по оси ординат – интенсивность флуоресценции R60-FITC (Ch2-T2). Уровень сигнала, считаемый шумом (Threshold), выставлен на 50 для обоих каналов. Данная величина представлена на рисунке белой линией. Пересечение 2 линий Threshold обоих каналов делят диаграмму на 4 части, обозначенные номерами 1, 2, 3 и участок без обозначения. Колокализованными являются только пиксели, попавшие в зону 3 на данной диаграмме. В зонах 1 и 2 находятся пиксели только от одного из каналов, а в зоне без обозначения – пиксели без флуоресцентного сигнала; на правом рисунке – это чёрный фон.

Коэффициенты колокализации рассчитываются как соотношение колокализованных пикселей к общему количеству детектируемых в данном канале пикселей и могут быть числами от 0 (нет колокализации) до 1. Расчёт проводят для каждого канала по формулам:

пикселиCh1.колокализованные пикселиCh2.колокализованные k1 = k2 = пикселиCh1.все пикселиCh2.все Пиксели, с интенсивностью менее уровня Threshold, в подсчёте не участвуют. Интенсивность пикселей роли не играет. Средние значения коэффициентов колокализации для двух каналов равны 0,075±0,009 и 0,329±0,059. Это значит, что 7,5% RTA расположено в тех же компартментах, где и цельный рицин, т.е. большая часть новообразованной RTA практически сразу транслоцируется из органелл, где накапливается рицин.

Рисунок 6. Распределение R60 и RTA через 12 часов инкубации Клетки глиомы С6 через 12 часов инкубации с токсином. Правый рисунок – оптический срез клетки, левый – диаграмма колокализации. Сигналы от обоих флуорохромов расположены в одном и том же месте, что внешне выглядит как жёлтые объекты вместо зелёных и красных.

Через 12 часов инкубации с рицином практически весь рицин и его А-цепь оказываются в одном компартменте. 76±4,5% RTA и 78±6,3% R60 находятся в одинаковых компартментах, что может быть свидетельством остановки везикулярного транспорта в клетках, обработанных токсином. На диаграмме (См. Рисунок 6) видно, что общее распределение пикселей представляет собой одну область, расположенную на прямой линии, в то время как на начальных этапах интенсивности флуоресценции обоих каналов увеличиваются независимо (См. Рисунок 5). Наличие неколокализованной свободной RTA объясняется ее выходом из компартмента, содержащего рицин на более ранних этапах. При этом A-цепь распределяется по цитоплазме, что не позволяет увидеть отдельные скопления.

Остановка синтеза белка, вызванная RTA, транслоцировавшейся ранее, приводит к остановке внутриклеточного транспорта. В результате, новообразующаяся RTA остаётся в компартменте, в котором она образовалась и оказывается колокализованной с рицином.

Для определения компартмента, содержащего свободную RTA, клетки глиомы Синкубировали с рицином, фиксировали 4% ПФА и обрабатывали конъюгатом 1RAK6AMI-Alexa 546 для выявления А-цепи. После этого добавляли маркёры клеточных органелл и анализировали взаимное расположение.

Конканавалин А широко используется в качестве маркёра ЭР. Конъюгат WGAFITC использовали в качестве маркёра ЭР и аппарата Гольджи. Показано, что RTA не попадает ни в аппарат Гольджи, ни в эндоплазматический ретикулум (См. Рисунок 7). Также свободная RTA не обнаружена в ядре, митохондриях и лизосомах.

Накопление рицина в ранних эндосомах показано ранее [Moisenovich et al., 2004].

Высокий уровень колокализации рицина и его каталитической субъединицы после остановки синтеза белка и следующей за этим остановки внутриклеточного транспорта, позволяет предполагать, что RTA накапливается в ранних эндосомах. Т.о. наиболее вероятным местом в клетке, где происходит восстановление дисульфидной связи с высвобождением RTA, является ранне-эндосомальный компартмент.

Рисунок 7. Распределение 1RAK6-AMI-Alexa 546 и WGA-FITC.

Взаимное распределение 1RAK6-AMI-Alexa 546 и WGA-FITC в клетках глиомы С6. A – флуоресцентный сигнал от конъюгатов 1RAK6-AMI-Alexa 546; Б – флуоресцентный сигнал от конъюгата WGA-FITC; В – наложение А и Б; Г – наложение В на изображение клетки в проходящем свете. Изображения А, Б и В получены путём совмещения всех оптических слоев («allmax»). Линейка – 10 мкм.

Митогенное действие рицина Анализ изображений клеток, предобработанных рицином, выявил незначительное увеличение митотического индекса. Известно, что величина этого показателя для линии 3T3 в норме составляет примерно 0,5-1,5%. Для изучения влияния рицина на митотический индекс культуры и оценки достоверности полученных данных использовали колхицин в концентрации 1 мкМ для увеличения митотического индекса.

25% 20% 15% 10% 5% 0% Рисунок 8. Митотический индекс Клетки инкубировали в присутствии токсинов 4 часа (кроме часовой точки с R60), после чего добавляли 1 мкМ колхицин, для увеличения митотического индекса.

Инкубация с рицином в концентрации, приводящей к гибели 50% клеток через 24 часа, в 2 раза увеличивает митотический индекс клеток линии 3T3 по сравнению с контрольными значениями. Данный эффект связан с активностью свободной RTA. Это следует из анализа воздействия смеси свободной RTB и ЦГИ – низкомолекулярного ингибитора синтеза белка, который мы использовали в качестве аналога RTA. Известно, что ЦГИ инактивирует рибосому так же, как и A-цепь рицина. Воздействие как отдельного ЦГИ, так и в паре с RTB приводит к полному подавлению вступления клеток в митоз.

Обнаружено, что митогенную активность свободная RTA проявляет только после транслокации в цитозоль. Так, часовая инкубация с рицином не повышает митотического индекса, а через 4 часа – время, через которое RTA накапливается в цитозоле в количествах, достаточных для детекции – митотический индекс повышается (См. Рисунок 8). Данный эффект наблюдается и при воздействии вискумина, что подтвержает наличие подобных свойств у A-цепей других РИБ2. Небольшие различия в действии рицина и вискумина, вероятно, объясняются различными путями внутриклеточного транспорта и могут быть следствием различий в цитотоксической активности данных токсинов.

Было изучено влияние низких нелетальных концентраций рицина и вискумина на пролиферативную активность клеток. Для этого использовали SRB-тест, позволяющий Митотический индекс н н с н н а и и и ин и с ь ча ц ц а ц ц ц л и ч и и и и о х х х х тр л л л лх л н о о н о о цин К К и Ко К Ко ц К и + + I+ х и B B+ И L х л T T л M R ЦГ Ко +R + Ко И 0+ ЦГ RRопределять общее количество белка (См. Рисунок 9). ЦГИ, используемый в качестве положительного контроля в широком диапазоне концентраций (10-5-10 мкг/мл) в данных условиях не приводил к изменению митотического индекса.

На рисунке видно различие в действии двух РИБ2. Достаточно высокие концентрации R60 практически не влияют на пролиферативную активность клеток. Но при снижении концентрации токсина эффект воздействия может достигать 400% от значений, полученных на клетках не подвергавшихся обработке токсинами (См. Рисунок 9). Это позволяет сделать вывод, что РИБ2 не только ингибируют синтез белка, но и обладают дополнительными действиями при попадании в цитозоль.

400% R300% ML200% 100% 0% -18 -17 -16 -15 -14 -13 -12 -11 -Концентрация токсинов Рисунок 9. Митогенное действие низких концентраций РИБВлияние низких концентраций R60 и ML1 на пролиферацию. Значения на оси абсцисс – концентрации токсинов 10-18-10-10 M соответственно.

Апоптотические изменения под действием РИБИнкубация с рицином приводит не только к увеличению митотического индекса, но и к запуску апоптоза. Активация апоптоза происходит при изменении соотношения про- и анти-апоптотических белков в клетке. Остановка синтеза белка приводит к изменению этого соотношения, однако не является единственным условием для запуска апоптоза. Образование фрагментов ДНК с молекулярной массой 180-200 пар нуклеотидов является свидетельством того, что клетки вступили на апоптотический путь гибели и в них уже активированы эффекторные каспазы. Для количественного определения клеток с Накопление белка в % от контроля фрагментированной ДНК использовали метод проточной цитофлуориметрии. Количество деградировавшей ДНК, разрушенной под действием токсинов и достаточное для детекции, наблюдается через 24 часа, и достигает максимальных значений, близких к 100%, через 48 часов (См. Рисунок 10). При этом ни в контрольных клетках, ни в клетках, инкубировавшихся с циклогексимидом, деградации ДНК не выявлено. Вероятно, изменение структуры рибосомы, происходящее под действием РИБ2 и приводящее к риботоксическому стрессу, играет в этом существенную роль.

SubG1 Контроль SubG1 RSubG1 ML0 время инкубации, ч Рисунок 10. Апоптотические изменения под действием РИБЧерез 24 часа под действием токсинов детектируются клетки в фазе SubG1.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»